刘琦 林峰

(上海市第八人民医院肿瘤科，上海 200235)

乏氧是一种细胞供氧不足的状态，发生在各种组织损伤中，包括缺血再灌注损伤、肺损伤、辐射诱导的正常组织损伤[1]。有研究报道，放射性后组织乏氧可加重放射性直肠损伤的发生[2]。乏氧可诱导活性氧(ROS)的产生，导致氧化应激，进而导致DNA、脂质和蛋白质损伤[3]。此外，ROS可激活氧化还原信号通路，导致内皮细胞死亡，诱导组织炎症和加重组织损伤[4]。然而，乏氧诱导细胞损伤的确切机制尚不清楚。microRNAs(miRNAs)是一种内源性、短的、非编码的RNA，能够结合靶基因mRNAs的3′-UTR，通过mRNA降解或抑制翻译在转录后水平抑制靶基因的表达[5]。有研究[6]表明miRNA-210可以通过下调乏氧条件下Bcl-2的表达降低结肠癌细胞的放射敏感性。本研究探讨乏氧条件下miR-210对成纤维细胞存活的影响。

1 材料与方法

1.1一般资料

1.1.1细胞系和培养条件 将人类皮肤成纤维细胞GM0639细胞在Dulbecco改良的Eagle′s培养基(法国Biowest)中培养。在三气培养箱(YCP-50S，长沙华西电子技术有限公司，中国)中于37°C，5%CO2，93%N2和2%O2的条件下进行乏氧处理。

1.1.2RNA分离和实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR) 使用TRIzol试剂(RNAprep Pure Cell/细菌试剂盒，天根，北京，中国)分离总RNA。miR-210逆转录引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTC AGCC-3′。所使用的实时PCR引物序列如下：miR-210 5′-CTGTGCGTGTGACAG-3′和miR-210反义序列，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和U6反义序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′; HIF-1α 5′-CGTTCCTTCGATCAGTTGTC-3′和HIF-1α反义序列，5′-TCAGTGGTGGCAGTGGTAGT-3′;BDNF5′-GAGCTGAGCGTGTGTGACAG-3′和BDNF反义序列5′-CTTATGAATCGCCAGCCAAT-3′。

1.1.3Western blot 用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(ThermoFisher，MA，USA)进行蛋白浓度定量。通过在10%(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE分离等量的蛋白质提取物，然后转移到BioTraceNC膜(美国纽约州Pall)上。用封闭缓冲液(5%(w/v)牛血清白蛋白，0.1%(w/v)Tween 20磷酸盐缓冲液)封闭1 h。用于western blot的抗体如下：抗HIF-1α(Epitomics，CA，美国)，NF-κB/p-NF-κBp65(Epitomics)，抗LC3(Medical&Biological Laboratories Co.，Ltd.(日本)和抗BDNF(英国Abcam)，辣根过氧化物酶偶联的第二抗抗兔抗体(Millipore，MA，美国)或抗小鼠抗体(Genetex，TX，USA)。……