许君伟 梁亚林 宋 丽

肝癌通常是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的慢性感染引起[1]，病理学活检为诊断的金标准，但其是有创性检查，近年来影像学诊断逐渐被广泛应用，但其诊断特异性仍待提高[2-3]。研究显示：乙肝发展到乙肝相关性肝癌涉及多基因与肿瘤标志物在不同节点的表达[4]。甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、肿瘤抗原199(CA199)等肿瘤标志物在一些恶性肿瘤的诊断、病情判断以及疗效监测方面具有一定临床价值[5]，但其特异性、敏感度仍不理想，因此更加可靠、准确的肿瘤标志物的相关研究仍是该肿瘤诊断的热点研究内容[6]。FOXM1(forkhead transcription factor M1)基因在多种肿瘤中广泛存在，可参与调控细胞增殖、分化、侵袭等。FOXO3a(forkhead box O3a)作为FOXM1上游调节因子，FOXM1/FOXO3a信号通路可以通过调节肿瘤细胞的生物学功能来发挥调控癌症发生与发展的作用[7-8]。本文具体探讨了FOXM1/FOXO3a在HBV相关性肝癌中的表达及临床意义，希望为乙肝相关性肝癌的诊断和治疗提供新的思路和方法。现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

于2015年8月到2020年5月选择的92例HBV相关性肝癌患者作为研究对象。纳入标准：原发疾病均经病理学证实为HBV相关性肝癌，临床及病理资料完整；无远处及淋巴转移；患者在病理检查前均未接受过化疗、放疗和其他抗肿瘤治疗；术前无严重的合并疾病；年龄20～75岁。排除标准：合并HCV感染的患者；伴有严重的其他疾病者；临床与病理资料缺乏者。

本研究得到了医院伦理委员会的批准与所有入选患者的知情同意。入选的92例患者中，年龄最小32岁，最大75岁，平均年龄(58.22±2.18)岁，其中≥60岁50例，<60岁42例；临床分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期35例，Ⅲ期22例；组织学分化：高分化43例，中分化27例，低分化22例；淋巴结转移45例；Child-Pugh分级：A级45例，B级47例；糖尿病史32例、高血压病史25例、吸烟史54例、饮酒史43例；病理特征：鳞癌32例，腺癌60例。实验室指标：谷丙转氨酶(ALT)(78.24±11.59)IU/l，谷草转氨酶(AST) (67.21±12.04)IU/l，谷氨酰氨基转移酶(GGT)(118.03±22.71)IU/l，乳酸脱氢酶(LDH)(220.19±32.71)IU/l，碱性磷酸酶(ALP)(132.19±34.19)U/l，AFP(872.71±128.29)μg/l，CEA(4.92±0.31)mg/l，CA199(58.22±14.29)U/ml。

1.2 FOXM1/FOXO3a表达检测

SP免疫组化试剂盒购自中杉金桥公司，FOXM1兔抗人多克隆抗体(工作浓度1∶500)、FOXO3a兔抗人多克隆抗体(工作浓度1∶200)购于博奥森生物技术有限公司。二甲苯茂军化工科技有限公司，PBS购自索莱宝生物科技有限公司，中性树胶购自迈新生物技术开发有限公司。

取所有患者的病灶组织标本与癌旁组织标本，按照石蜡切片常规步骤进行制片并切片，然后经柠檬酸缓冲液高压抗原热修复预处理。取出抗原修复盒，待修复液自然冷却，PBS洗涤3次，滴加3% H2O2，室温静置10 min；PBS洗涤3次，滴加正常山羊血清封闭液，室温10～15 min。滴加抗MFGE8抗体2 μl，置于湿盒内，4 ℃过夜。PBS洗涤3次，滴加复合二抗2 μl，室温静置20 min；PBS洗涤3次后DAB显色，光学显微镜下观察并拍照。

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1.3 预后随访

以手术日期为起始时间，随访截至日期为2020 年8月1日，通过微信、门诊、电话、入户等随访方式，调查患者的预后生存与死亡情况。

1.4 统计方法

不同组织学分化、临床分期、淋巴结转移、Child-Pugh分级患者的FOXM1、FOXO3a表达阳性率对比差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2 结果

2.1 FOXM1/FOXO3a表达水平对比

在92例HBV相关性肝癌患者中，病灶组织的FOXM1、FOXO3a表达阳性率为72.8%和83.7%，都显著高于癌旁组织的33.7%和23.9%(P<0.05)。见表1。

表1 不同组织的FOXM1/FOXO3a表达水平对比(例，%)

2.2 肝癌临床病理特征与FOXM1/FOXO3a的相关性

应用SPSS 22.00进行统计分析，通过百分比以及均数±标准差来表示计数数据与计量数据，比较分别采用χ2检验和t检验，Pearson进行相关分析，COX进行多因素回归分析，检验水准α<0.05。

表2 不同临床病理特征HBV相关性肝癌患者的FOXM1/FOXO3a表达水平对比(例，%)

叉头框(forkhead box，FOX)蛋白具有“翼状螺旋结构”DNA结合域的转录因子，人类FOXM1基因定位12p13-3c，可刺激细胞由静止期进入到细胞周期，从而调控细胞周期、细胞凋亡与增殖，从而与多种恶性肿瘤存在相关性[12]。FOXO3a定位于6q21，编码673 个氨基酸，为胰岛素/磷酸肌醇-3激酶的重要信号通路因子，其活性水平受到蛋白质-蛋白质相互作用、基因表达水平、翻译后修饰、蛋白质稳定性等多种因素的影响[13]。本研究显示在92例HBV相关性肝癌患者中，病灶组织的FOXM1、FOXO3a表达阳性率为72.8%和83.7%，都显著高于癌旁组织的33.7%和23.9%(P<0.05)，表明FOXM1/FOXO3a信号通路在乙肝相关性肝癌中呈现激活表达状态。

选用由吉林大学基础医学院提供的清洁级Wistar大鼠，雌、雄大鼠比例为1：1，体重250～280 g。

提升社会力量的食品安全监督力度。社会监督组织应该不断强化自身的职责，在政府等相关部门的有效引导下，整合政府和食品企业发布的各项信息资源，利用媒体宣传等手段表达自己的诉求。在日常的生活中一旦发现违法的食品企业或行为，应立即举报。除此之外，法律监督部门也应该强化自身职责，利用立法和检举等方法从根源上杜绝食品安全问题的发生[2]。

表3 HBV相关性肝癌患者的FOXM1/FOXO3a表达水平与临床病理特征的相关性(n=92)

2.3 预后情况

所有患者随访到2020 年8月1日，平均随访时间(25.82±1.38)个月，92例患者中死亡42例，死亡率为45.6%。

2.4 影响因素分析

肝癌为临床上常见的恶性肿瘤之一，具有预后差，恶性程度高等特点。HBV相关性肝癌是原发性肝癌中的一种最主要类型，沿海地区高发，可发生于任何年龄段[9]。该肿瘤早期起病隐匿，往往发病就诊时患者已处于中晚期，且常伴有癌栓与淋巴结转移情况，使得其根治性手术切除的应用受到极大的限制，因而死亡率较高[9]。随着分子生物学的发展，研究已表明癌基因激活与肿瘤抑制基因失活、等位基因的杂合性缺失、染色体不稳定与失衡、表观遗传性基因沉默等与癌症发生发展密切相关，临床上也已经出现了针对特定分子的靶向药物治疗[10-11]。

表4 乙肝相关性肝癌患者预后死亡的多因素分析(n=92)

3 讨论

在92例HBV相关性肝癌患者中，以预后死亡作为因变量，COX回归分析显示组织学分化、临床分期、淋巴结转移与FOXM1、FOXO3a表达阳性率为影响患者预后死亡的主要因素(P<0.05)。见表4。

Pearson相关分析显示患者的组织学分化、临床分期、淋巴结转移、Child-Pugh分级与FOXM1、FOXO3a表达阳性率都存在相关性(P<0.05)。见表3。

阳性判定标准：对细胞染色程度和阳性百分比进行乘积评分，两项得分乘积≤3分为阴性，>3分为阳性。

本研究显示不同组织学分化、临床分期、淋巴结转移、Child-Pugh分级患者的FOXM1、FOXO3a表达阳性率对比差异都有统计学意义(P<0.05)；Pearson相关分析显示患者的组织学分化、临床分期、淋巴结转移、Child-Pugh分级与FOXM1、FOXO3a表达阳性率都存在相关性(P<0.05)。从机制上分析，FOXM1是一个重要的细胞周期调控因子，可调控肿瘤细胞增殖和侵袭等[14]。FOXM1过表达和E-cadherin表达下降与恶性肿瘤组织分化差、淋巴结转移显著相关，RNA干扰介导的FOXM1敲低能够显著抑制恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭与迁移[15]。FOXO3a是FOXM1转录因子的上游调节基因，也是PI3K-AKT信号通路的重要下游效应物，FOXM1/FOXO3a信号通路可以通过调节细胞增殖、凋亡、迁移、血管生成来调节恶性肿瘤的起始，也可影响肿瘤的病理特征[16-17]。

本研究所有患者随访到2020 年8月1日，平均随访时间(25.82±1.38)个月，92例患者中死亡42例，死亡率为45.6%；COX回归分析显示组织学分化、临床分期、淋巴结转移与FOXM1、FOXO3a表达阳性率为影响患者预后死亡的主要因素(P<0.05)。不过本研究也有一定的不足，研究的样本数量较少，影响患者预后的因素比较多，因此研究可能存在一定的偏倚性，将在下一步进行深入分析。

管道平面设计原则：一要线路短、起伏小、土石方工程量小、造价经济；二要考虑拐点数量、角度、过路、过沟，同时考虑避让村庄、房屋、田地、输电线路杆塔、坟地，减少拆迁及附着物赔偿费用；三要尽量避免穿越河谷、山脊、沼泽和泄洪地区；四要考虑近远期结合和分期实施的可能。

用三维软件建立实体三维模型，在有限元仿真分析软件中对三维模型进行网格划分和材料属性添加。实体三维模型如图1所示。

总之，乙肝相关性肝癌的发病与FOXM1/FOXO3a信号通路的激活密切相关，且其相关蛋白的表达与患者的临床病理特征显著相关，可作为患者预后死亡评估的重要影响指标。