方 玲 夏永欣 田春阳

胃癌是临床上最常见的消化道肿瘤之一，当前胃癌每年新发病例在百万人左右，而有效的早期检测诊断方法缺乏，致使很多患者在确诊时就已处于晚期，失去了根治性手术的可能，因此死亡率一直居高不下[1-2]。胃癌的发生机制还不明确，不过可能是先天性与后天性因素共同作用的结果，包括幽门螺杆菌感染、吸烟、肺炎、体细胞突变、基因扩增和缺失、基因失活和异常DNA甲基化、不良饮食习惯等[3-4]。而寻找胃癌发生的诊断标志物及探讨胃癌发生的分子机制，对早期预防胃癌具有重要的价值[5]。DOK蛋白家族包括DOK1、DOK2、DOK3、DOK4等，都拥有DOK家族类似结构，含有多个酪氨酸蛋白激酶位点[6]。DOK3和DOK2为受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶信号通路的常见底物，包括表皮生长因子受体、血小板源生长因子受体等。DOK3和DOK2的过度表达可负性调节ERK4、MYC等因素，从而参与细胞增殖、凋亡、生长和迁移等多种过程[7-8]。最近研究表明DOK蛋白为肿瘤抑制因子，可以抑制恶性肿瘤的发生[9-10]。本文具体探讨了DOK3和DOK2的表达在早期胃癌诊断及与其病理变化中的意义，希望为胃癌的临床诊治干预策略提供生物学基础。现总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本研究获得医学伦理委员会的批准，且所有患者都自愿签署了知情同意书。将2017年1月至2020年6月在本院诊治的早期胃癌80例作为胃癌组，同期选择在本院诊治的胃癌前病变患者80例作为对照组。纳入标准：经病理学检查证实诊断为胃癌或胃癌前病变；年龄30～80岁；所有患者在获取标本前未接受治疗。排除标准：妊娠与哺乳期妇女；伴有其他部位恶性肿瘤者；全身感染性疾病者；临床与检测资料缺乏者。

对照组男性42例，女性38例；年龄32～78岁，平均年龄(48.02±5.22)岁；疾病类型：慢性浅表性胃炎29例，低级别上皮内瘤变31例，高级别上皮内瘤变20例。胃癌组男性45例，女性35例；年龄30～80岁，平均年龄(48.94±4.44)岁；临床分期：Ⅰ期50例，Ⅱ期30例；淋巴结转移25例；组织学分化：高分化42例，中分化18例，低分化20例；病灶直径≥4 cm 40例，病灶直径<4 cm 40例。2组患者的性别、年龄等对比差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 血清学检测

采集所有患者的空腹外周静脉血3～5 ml，室温条件下待外周血自然凝固(30 min左右)后离心5 min(1 000 rpm/min)，取上层血清在-80 ℃冰箱保存。提取血液的总RNA，逆转录为cDNA，内参照为U6，引物由上海生工公司合成。采用实时荧光定量PCR仪(瑞士罗氏诊断公司)检测与计算DOK3和DOK2相对表达水平。上述检测qPCR检测试剂盒均购买于上海吉码公司，逆转录试剂购自日本TaKaRa公司，DOK3引物(5'-TCAGCGGATATA-ATACAACCTGC-3'，5'-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTCAC-3')，DOK2引物(5'-ATTGGAACGAIACAGAGAAGATG-3'，5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3')。

1.3 统计方法

计量数据以均数±标准差等表示，计数数据以百分比表示，选择SPSS 19.00软件进行统一分析，计量数据对比采用t检验，计数数据对比采用卡方分析，分析生存曲线通过Kaplan Meier方法与log-rank检验生成，相关性分析采用Pearson分析，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 血清DOK3和DOK2表达水平对比

胃癌组中的血清DOK3和DOK2相对表达水平都显著低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 2组血清DOK3和DOK2相对表达水平对比

2.2 DOK3、DOK2的表达与胃癌临床病理特征的相关性

在胃癌组中，不同组织学分化、临床分期、淋巴结转移、病灶直径的血清DOK3和DOK2表达水平对比差异都有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 早期不同病理特征胃癌患者血清DOK3和DOK2表达对比

2.3 相关性分析

在胃癌组中，Pearson分析显示血清DOK3、DOK2表达与组织学分化、临床分期、淋巴结转移、病灶直径都存在相关性(P<0.05)。见表3。

表3 早期胃癌患者血清DOK3、DOK2表达与病理特征的相关性(n=80)

2.4 预后情况

所有胃癌患者随访2020年8月，生存64例，死亡16例，死亡率为20.0%。死亡患者的血清DOK3和DOK2表达水平显著低于生存患者(P<0.05)。见表4。

表4 早期胃癌不同预后患者的血清DOK3和DOK2表达对比

3 讨论

胃癌是最常见的癌症之一，主要分布在亚洲、欧洲与美洲等地区，早期胃癌的诊断率低于10%，不能进行根治性手术切除，因此死亡率一直居高不下。已有研究显示胃癌的恶性进展速度已经超过治疗的治愈速度，从而严重影响患者的身心健康[10]。胃癌的发生是一个复杂的、多阶段、多因素相关的事件，也是一个胃炎-肠上皮化生-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变的连续过程[11]。DOK3和DOK2都为一种接头蛋白，参与负反馈调节酪氨酸激酶受体介导的信号传递[12]。抑制DOK3和DOK2的表达均可以促进恶性肿瘤的发生，提示它们为恶性肿瘤的抑癌基因[13]。本研究显示胃癌组中的血清DOK3和DOK2相对表达水平都显著低于对照组(P<0.05)，表明胃癌患者多伴随有血清DOK3和DOK2的低表达。从机制上分析，DOK2和DOK3是关键酪氨酸激酶的底物，两者都可以下调人巨噬细胞集落刺激因子刺激的巨噬细胞反应，可以抑制PTK介导的致癌信号[14]。

胃癌的增殖、分化与转移是1个多步骤的生物级联的过程，尤其是癌基因的活化和抑癌基因的失活起着重要作用。胃癌早期主要转移到淋巴结、肝脏、腹膜等部位，通过直接侵入或通过血液、淋巴系统等途径进行更远距离的播种[15]。DOK家族的成员都具有典型的结构特征：N端的PH结构域，负责将蛋白定位到细胞膜上；中间的磷酸化酪氨酸结合结构域，介导DOK家族蛋白与磷酸化酪氨酸的结合；C端序列富含脯氨酸，可作为活化的蛋白酪氨酸激酶诱导的信号复合物组装的平台[16]。本研究显示不同组织学分化、临床分期、淋巴结转移、病灶直径胃癌患者的血清DOK3和DOK2表达水平对比差异都有统计学意义(P<0.05)；Pearson分析显示胃癌患者的血清DOK3、DOK2表达与组织学分化、临床分期、淋巴结转移、病灶直径都存在相关性(P<0.05)。当前也有研究显示DOK3在低级别的消化道炎症病变中呈现高表达状况，而在消化道恶性肿瘤中呈现低表达状况[17]。

胃癌的过渡增殖伴随有一些生长因子的过度表达，生长因子与受体结合触发位于胞膜上的受体形成二聚复合物，过度活化胞内区酪氨酸激酶，下游信号途径中关键蛋白元件受到持续激活，引起信号转导紊乱，从而导致恶性肿瘤的发生[18-19]。本研究显示在胃癌组中，死亡患者的血清DOK3和DOK2表达水平显著低于生存患者(P<0.05)。从机制上分析，DOK3和DOK2表达下降可能提高胃癌上皮细胞的粘附能力与浸润能力，促进胃癌患者的病变进展，从而使得患者的死亡率上升[20-21]。本研究也有一定的不足，样本数量较少，且随访时间比较短，将在后续研究中深入探讨。

总之，早期胃癌患者血清DOK3和DOK2水平均显著降低，且该两个指标与患者的病理特征存在相关性，也可作为预测预后的有效标志物。