庄星星，倪受东，陈明，苗仁华，张鹏，李萌

安徽医科大学附属巢湖医院 安徽巢湖 238000

细辛、干姜两味中药均首见于《神农本草经》 “细辛，味辛，性温。主咳逆，头痛，脑动，百节拘挛，风湿痹痛，死机”具有解表散寒、祛风止痛、通窍、温肺化饮的功效[1]。“干姜，味辛，性温。主胸满，咳逆上气，温中止血，出汗，通神明，生川谷”具有温中散寒，回阳通脉，温肺化饮的功效[2]。“细辛-干姜”药对配伍最早见于汉代张仲景所著《伤寒杂病论》中的小青龙汤。细辛温中下气，破痰利水道，干姜温通上焦心肺，两药配伍达到温肺化饮的功效[3]。《中药方剂数据库》中检索出含“细辛-干姜”药对的方剂约273首，临床主治症广泛，其中以呼吸系统的疾病，如咳喘、痰饮以及风寒感冒最为多见[4]。

药理学研究表明“细辛-干姜”药对可有效降低COPD大鼠血清TNF-a和IL-8 含量，升高 IL-2 含量，改善肺功能，减轻气道炎症，延缓或打断 COPD 的发展，药对药效优于单味中药[5]。网络药理学研究也表明细辛、干姜两药配伍使用具有协同作用，隐亭、芝麻脂素和邻苯二甲酸二丁脂可能是药对功效机理发挥的重要物质基础；前列腺素G/H合酶2、β2-肾上腺素能受体、促细胞分裂蛋白激酶2和热激蛋白90可能是药对活性成分发挥作用的潜在靶点[6]。

课题组前期研究和文献资料调研的基础上，以细辛中的主要活性成分细辛脂素、芝麻脂素[7]和干姜中的6-姜酚、6-姜烯酚[8]为指标，结合HPLC特征指纹图谱，定量分析“细辛-干姜”药对配伍前后药材中指标成分的含量变化以及定性分析指纹图谱变化，从化学层面探讨药对配伍的可能机理。

仪器与材料

1 仪器

1260 II高效液相色谱仪配置四元泵、VWD检测器、OpenLAB工作站（美国 Agilent公司）；BT25S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；FA1204B电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；KMD-500调温电热套（金坛市鸿科仪器厂）；RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TGL16E高速离心机（长沙英泰仪器有限公司）；JK100B超声波清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）。

2 材料

细辛脂素对照品（20mg/支，纯度：99.70%，批号：DC-19080704）；芝麻脂素对照品（20mg/支，纯度：99.75%，批号：DC-19111607）；6-姜酚对照品（20mg/支，纯度：99.69%，批号：DC-19040810）6-姜烯酚对照品（20mg/支，纯度：99.70%，批号：DC-19061204）购自南京滴纯生物科技有限公司。细辛饮片和干姜饮片购自亳州市华鑫中药饮片科技有限公司，经安徽医科大学附属巢湖医院倪受东副主任中药师鉴定分别为马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag. 的干燥根和根茎和姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎，药材产地和批号见表1。

甲醇（色谱纯，批号：20180302，天津基准化学试剂有限公司）；超纯水由安徽医科大学附属巢湖医院检验科提供。

表1 药材的产地和批号信息

方法和结果

1 供试液制备

称取细辛、干姜各12.0 g，根据前期正交试验优选的最佳水提取工艺：浸泡浸泡1小时，加6倍量水（首煎考虑药材吸水率，加水量为8倍），提取2 h，提取3次。所得提取液混合浓缩定容至50.0 mL 容量瓶中。细辛和干姜单煎液分别标记细辛S1-S10和干姜S1-S10，细辛-干姜混煎液标记混煎S1-S10。备用。

精密吸取浓缩液各10.0 mL 分别置蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加75%甲醇溶解，0.22 μm微孔滤膜滤过，转移至10.0 mL量瓶中，超声30 min，冷却后定容，备用。

2 对照品溶液制备

精密称取细辛脂素、芝麻脂素、6-姜酚和6-姜烯酚适量，分别置于不同容量瓶中，甲醇溶解，制成浓度1.0 mg/mL的细辛脂素、芝麻脂素、6-姜酚和6-姜烯酚对照品溶液。

精密吸取浓度细辛脂素对照品溶液200μL、芝麻脂素对照品溶液100μL、6-姜酚对照品溶液200.00μL和6-姜烯酚对照品溶液200.00μL置于同一100mL容量瓶，甲醇定容，制成细辛脂素浓度2.00μg/mL、芝麻脂素浓度1.00μg/mL、6-姜酚浓度2.00μg/mL和6-姜烯酚浓度2.00μg/mL的混合对照品溶液。

3 指纹图谱建立及分析

3.1 色 谱 条 件 Agilent EC-C18（4.6×150mm，4μm）；柱温 30℃；检测波长：205nm；流速：1.0mL/min；流动相为甲醇和水，洗脱程序：0～15min，25%甲醇；15 ～ 30min，25%~50% 甲醇；30 ～ 45min，50%甲 醇；45～ 46min，50% ～ 25% 甲 醇；46～ 50min，25%甲醇。进样量：40μL。

3.2 精密度试验 取“1”项下所得供试品溶液，在“3.1”项色谱条件下连续进样6次，建立指纹图谱，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）》进行相似度评价。结果各共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD 均＜3%，表明仪器精密度良好。

3.3 稳定性试验 取“1”项下所得供试品溶液，在“3.1”项色谱条件下分别于 0、1、2、4、8、16、24 h 依次进样检测，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）》进行相似度评价。结果各共有峰相对保留时间及相对峰面积 RSD 均＜3%，表明24h 内供试品溶液的成分稳定。

3.4 重复性试验 取细辛、干姜各12.0 g，按“1供试液制备”方法平行制备供试品溶液6份，在“3.1”项色谱条件下进样检测。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）》进行相似度评价。结果各共有峰相对保留时间及相对峰面积 RSD 均＜3%，表明重复性良好。

3.5 指纹图谱的建立 将“1”项下所得供试液和“2”项下所得混合对照品溶液，在“3.1”项色谱条件下检测，分别得到10批细辛单煎液、10批干姜单煎液、10批细辛-干姜混煎液的HPLC指纹图谱以及混合对照品指纹图谱。将所得的指纹图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）》多点校正，自动匹配生成对照图谱。混合对照品HPLC图谱、10批细辛单煎液、10批干姜单煎液以及10批细辛-干姜混煎液的HPLC指纹图谱见图1-4。

3.6 配伍前后指纹图谱的变化分析 建立10批细辛HPLC指纹图谱，确定了9个共有峰。通过与混合对照品HPLC图谱对比，确定6号峰为芝麻脂素，7号峰为细辛脂素，见图2。建立10批干姜HPLC指纹图谱，确定了13个共有峰。通过与混合对照品HPLC图谱对比，确定8号峰为6-姜酚，11号峰为6-姜烯酚，见图3。

建立10批细辛-干姜混煎液HPLC指纹图谱（见图4），确定了17个共有峰。通过与混合对照品HPLC图谱对比，确定9号峰为6-姜酚，，12号峰为芝麻脂素，13号峰为细辛脂素，14号峰为6-姜烯酚。通过对比细辛、干姜单煎液和细辛-干姜混煎液的HPLC指纹图谱，对药对HPLC指纹图谱确定的17个峰进行初步归属：3、7、11、12、16 号峰来源于细辛；1、2、4~6、8~10、14、15、17号峰来源于干姜。结果发现药对共煎的过程中没有含量较大的组方产生或消失。细辛、干姜单煎液HPLC指纹图谱中部分面积较小的峰，在药对共煎液的HPLC指纹图谱中并未出现，可能是共煎过程中影响了该类成分的溶出，见图4。

4 指标性成分含量测定

4.1 线性关系考察 按照“3.1”项下色谱条件，将“2”项下所得混合对照品溶液，甲醇稀释至 0、2、4、8、16、32倍，制成系列混合对照品溶液，分别进样40μL，以色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X，μg/mL）为横坐标，得6-姜酚、芝麻脂素、细辛脂素和6-姜烯酚的标准曲线方程及线性范围。结果见表2。

图1 对照品HPLC色谱图

图2 10批细辛药材HPLC指纹图谱

图3 10批干姜药材HPLC指纹图谱

4.2 精密度试验 取“2”项所得混合对照品溶液，在“3.1”项色谱条件下，连续进样6次，记录各指标性成分峰面积。结果6-姜酚、芝麻脂素、细辛脂素和6-姜烯酚平均峰面积的RSD分别为0.96%、1.09%、1.13%、1.32%，说明仪器精密度良好。

图4 10批“细辛-干姜”药对HPLC指纹图谱

表2 各指标性成分的标准曲线方程、相关系数及线性范围

4.3 稳定性试验 取“2”项下所得混合对照品溶液，在“2.3.1”项色谱条件下，分别于 0、2、4、8、16、24 h 依次进样。结果6-姜酚、芝麻脂素、细辛脂素和6-姜烯酚平均峰面积的RSD分别为0.36%、0.87%、0.92%、0.54%，说明混合对照品溶液在24 h内稳定性良好。

4.4 重复性试验 取细辛、干姜各12.0 g，按“2.1”项方法，平行制备供试品溶液6份，在“2.3.1”项色谱条件下进样检测。结果结果6-姜酚、芝麻脂素、细辛脂素和6-姜烯酚平均峰面积的RSD分别为2.31%、2.85%、3.06%、3.32%，说明方法重复性良好。

5 样品含量测定

取“1”项下所得10批细辛单煎液、10批干姜单煎液、10批细辛-干姜混煎液，在“3.1”项色谱条件下进样检测。计算供试品溶液细辛脂素、芝麻脂素、6-姜酚和6-姜烯酚浓度。用SPSS17.0对不同组别间的浓度测定结果做统计分析，P＜0.05表示差异具有显著性。

“细辛-干姜”药对混煎中6-姜酚、芝麻脂素、细辛脂素和6-姜烯酚的浓度较药材单煎液中的浓度相当，说明细辛和干姜混煎过程中部分指标性成分的溶出度未见明显变化。结果见表3。

讨 论

中药药对研究是方剂研究的基础，是阐明中医遣药组方机理的重要途径。相比简单单味中药，药对的配伍机理研究更能体现中医的“药”和“方”的科学内涵。中药药对的研究作为研究热点，学者们通过研究中医方剂中常见的中药药对，发现药对的配伍机理主要体现在三个方面：一是化学成分变化，药对经过配伍后，由于两药之间发生化学反应使得主要药效成分的溶出率[9]发生变化，或者产生新的药效成分[10]；二是药动学改变，药对经过配伍后，由于中药成分复杂，各成分之间在体内发生相互作用或者影响体内主要代谢酶活性使得主要活性成分体内药动学过程发生了改变[11-12]。三是药理学变化，药物配伍后由于化学成分间的相互作用，使得药效学物质基础发生改变，使得进入机体组织或者细胞后作用的靶点增多，通过不同生化通路起到协同作用从而增强药理作用[13]。

表3 细辛、干姜配伍前后指标性成分的含量测定结果（，n=10）μg/mL

表3 细辛、干姜配伍前后指标性成分的含量测定结果（，n=10）μg/mL

样品 细辛脂素 芝麻脂素 6-姜酚 6-姜烯酚细辛单煎液 0.1655±0.0069 0.1346±0.0136 － －干姜单煎液 － － 0.1148±0.0270 0.2522±0.798药对混煎液 0.1768±0.0083 0.1388±0.0213 0.1238±0.0301 0.2368±0.1185

“细辛-干姜”药对配伍前后的指纹图谱变化进行分析，药对指纹图谱主要贡献来自于干姜。细辛单煎液的HPLC指纹图谱确定了9个共有峰，干姜单煎液的HPLC指纹图谱确定了13个共有峰。药对混煎液的HPLC指纹图谱确定了17个共有峰，其中12个来源于干姜，5个来源于细辛，提示细辛和干姜在配伍后，多数特征成分的溶出度未见明显变化。归属性分析提示药对混煎液的HPLC指纹图谱没有新增的物质峰产生，说明药材中的化学成分之间相对稳定。药对混煎液中的指标性成分6-姜酚、芝麻脂素、细辛脂素和6-姜烯酚浓度和药材单煎液中的浓度相当，说明在药对混煎过程中，虽然各药材中的化学成分相互影响，作为主要指标性成分的溶出度未见明显变化，“细辛-干姜”药对的配伍机理需要进一步研究。