邓佑林　冉思妍　苏慧仁　李芳芳　张鹏　黄秀香

摘  要：用乙醇-水混合溶液从广西宜州的火棘果（Pyracantha fortuneana（Maxim.） Li）中提取总多酚，在单因素实验的基础上，通过响应面优化法得到影响D-101大孔树脂吸附火棘果总多酚的优化条件，并建立数学模型;探讨了溶液pH值、吸附时间和吸附温度对火棘果总多酚吸附率的影响，并对实验的显著性和方差进行了分析，结果表明最佳条件为吸附时间120 min、溶液pH值5、吸附温度70 ℃，火棘果总多酚的提取率为0.244 72%，模型预测值为0.238 70%，组合实验结果比模型预测值小0.006 02%.

关键词：火棘果;大孔树脂;响应面法;总多酚;提取工艺

中图分类号：TQ353DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.02.016

0引言

火棘果（Pyracantha fortuneana（Maxim.）Li）又称为火把果、水杈子、水红子[1-3]等，属于蔷薇科火棘属苹果亚科[4]，在广西主要分布在山地丘陵.火棘果具有降血脂、抗氧化、美白等功效，多酚类化合物具有抗病原微生物、抗肿瘤、延缓机体衰老和抗氧化等功能[5-7].随着人们对生活品质要求的提高，健康问题和形象保养越来越受到关注，而火棘果在食用、药用、化工、生态等方面都有着较好的开发前景[8-12]，所以火棘果总多酚的研究具有较广阔的前景和较好的研究价值.深入研究火棘果，既可以充分利用当地资源，又可为广西的经济发展提供一定的效益.

本研究使用D-101大孔树脂分离火棘果总多酚[13-20]，进行3个单因素实验：溶液的pH值、吸附时间和吸附温度，然后根据Box-Behnken的实验设计原理进行了响应面实验，得到回归方程后建立模型进行显著性分析，得到了最优工艺条件，并在最佳条件下进行了验证实验，结果表明此方法可行.

1   材料与方法

1.1  仪器与试剂

1.1.1   主要试剂及材料

试剂：福林酚试剂、盐酸、氢氧化钠、无水碳酸钠、乙醇、没食子酸标准品等均为分析纯，试剂购于西陇化工股份有限公司和成都金山化学试剂有限公司，实验用水为超纯水，超纯水取于河池学院化学与生物工程学院.

材料：火棘果采摘于广西宜州，干燥后，用粉碎机粉碎后过30目（550 μm）筛，保鲜保存备用.D-101大孔吸附树脂购自天津市光复精细化工研究所，规格是HG2-885-76.

1.1.2   主要仪器

主要仪器有：Agilent8453紫外-可见分光光度计（安捷伦科技有限公司）、KQ-250DE数控超声波清洗器（巩义市予华仪器责任有限公司）、DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥机 （上海一恒科学仪器有限公司）、200A-1摇摆式高速万能粉碎机（永康市云达冷风机厂）、DISCV-I-18超纯水机（成都艾柯水处理设备有限公司）、HH-S4恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）等.

1.2实验部分

1.2.1   树脂预处理

将新采购的D-101大孔树脂在超纯水中浸泡24 h，树脂溶胀后，冲洗至水无颜色，并分别用4%氢氧化钠溶液和4%盐酸溶液浸泡12 h，换溶液时树脂用水洗至中性，最后在蒸馏水中浸泡2 h～  4 h，处理后的湿树脂保存于冰箱中备用，使用前充分摇匀[20].

1.2.2   提取总多酚

准备250 mL的锥形瓶，称取火棘果粉12.5 g于其中，加入87.5 mL的 70%乙醇水溶液并封住锥形瓶口，在60 ℃的超声波清洗机中超声提取 60 min，抽滤，滤液用70%乙醇水溶液定容至   250 mL，冷藏备用.

1.2.3   福林酚比色法

在样液中加入5.0 mL超纯水进行稀释后，再加0.5 mL福林酚试剂进行混合，充分反应1 min后，滴加1.5 mL 20%碳酸钠溶液到混合溶液中，利用超纯水进行定容，最后，在75 ℃条件下反应   10 min，用紫外-可见吸收光谱仪在760 nm波长下测定混合溶液的吸光度[21].

1.2.4   不同溶液pH值對总多酚的吸附影响

于5个100 mL具塞的锥形瓶中放入5.0 mL按1.2.2节方法制得的火棘果提取液，用盐酸和氢氧化钠配置的稀溶液，将火棘果提取液的pH分别调至3、4、5、6和7，按固液比1∶10（m（g）∶V（mL））加入处理过的湿树脂0.5 g，于60 ℃恒温水浴锅中吸附120 min，抽滤;滤渣转入100 mL锥形瓶，并加5.0 mL的60%乙醇-水溶液，60 ℃下解析120 min，再次进行抽滤，将滤液转移入5个10 mL容量瓶中，按1.2.3节方法测定溶液吸光度.

1.2.5不同吸附时间对总多酚的吸附影响

于6个100 mL具塞的锥形瓶中放入5.0 mL按1.2.2节方法制得的火棘果提取液，并按固液比 1∶10（m（g）∶V（mL））各加入处理过的树脂0.5 g，让它分别吸附30 min、60 min、90 min、120 min、150 min和180 min（恒温水浴锅中的温度是60 ℃），抽滤;备好6个100 mL具塞的锥形瓶，并将上述步骤所得的滤渣转移到其中，各加5.0 mL的 60%乙醇水溶液，60 °C解析120 min，抽滤，分别将滤液转移至6个10 mL容量瓶中，按1.2.3节方法测定吸光度.

1.2.6   不同吸附温度对总多酚的吸附影响

于5个100 mL具塞的锥形瓶中放入5.0 mL按1.2.2节方法制得的火棘果提取液，分别放在不同温度的恒温水浴锅中，温度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃，按1∶10（m（g）∶V（mL））的固液比，加入0.5 g处理过的大孔吸附树脂，在60 ℃的恒温水浴锅中吸附120 min，抽滤;准备5个100 mL具塞的锥形瓶，并将滤渣全部转移至其中，加入5.0 mL的 60%乙醇水溶液，于60 ℃超声波清洗机上解析120 min，抽滤，准备5个10 mL容量瓶，分别将滤液转移至其中，按1.2.3节方法测定吸光度.

1.2.7   标准曲线的建立与绘制

准确称取质量为0.01 g的没食子酸对照品，溶于超纯水中并定容至100 mL，得0.10 mg/mL的标准溶液.分别量取0.10 mg/mL标准溶液0 mL、  0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL于 10 mL容量瓶中，按1.2.3节福林酚比色法处理后，用紫外-可见吸收光谱仪在400～800 nm范围进行全波长扫描，在最大吸收波长760 nm处测定吸光度.没食子酸标准曲线测定结果如表1所示，根据表1绘制标准曲线得回归方程y=103.07x + 0.008 2，如图1所示.

1.2.8   含量测定

准备25 mL的容量瓶，移取2.0 mL火棘果提取液置于其中，按1.2.3节方法测定吸光度.火棘果总多酚提取率计算方法如下：

[X=cV1V2MV3]

其中：[X]为火棘果中总多酚质量分数;c为溶液质量浓度，mg/mL;[V1]为稀释体积，mL;[V2]为火棘果提取液体积，mL;[V3]为火棘果提取液取样体积，mL;[M]为火棘果粉末质量，g.

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1   不同pH值对树脂吸附总多酚的影响

[pH值对树脂吸附总多酚的影响如图2所示.     ]

研究在固液比为1∶10（m（g）∶V（mL）），提取温度为60 ℃，提取时间为120 min的条件下，溶液的不同pH值对火棘果总多酚提取率（W）产生的影响，由图2可见，当pH值从3到5时，因为树脂的吸附量低于解吸量，所以W逐渐增大;当pH值为5时，吸附量和解吸量达到平衡，W达到最大值  0.212 1%;当pH值在5之后，吸附量比解析量低，所以W减小.因此得出：pH值过大或者过小都会影响总多酚的提取率，根据实验结果分析得出，pH值应选择5.

2.1.2   不同吸附时间对树脂吸附总多酚的影响

[吸附时间对树脂吸附总多酚的影响如图3所示.       ]

研究在固液比为1∶10（m（g）∶V（mL）），提取温度为60 ℃，溶液pH值为5的条件下，由于吸附时间的变化，其对火棘果总多酚提取率（W）产生的影响.由图3可见，随着吸附时间逐步由30 min增加至150 min，因为吸附量处于未饱和状态，吸附持续进行，W增大;当吸附时间为150 min时，树脂吸附达到平衡，吸附量不再改变，此时W最大值为0.249 5%;当吸附时间在150 min之后，已吸附的总多酚被氧化，W减小.所以最佳吸附时间为150 min.

2.1.3   不同吸附温度对树脂吸附总多酚的影响

[吸附温度对树脂吸附总多酚的影响如图4所示.       ]

研究在1∶10（m（g）∶V（mL））的固液比，pH值为5，提取时间为120 min的条件下，改变进行吸附时的温度，对火棘果总多酚的提取率（W）的影响.由图4可知，当吸附温度从40 ℃上升到60 ℃时，因为树脂吸附不活跃，吸附量小，所以温度越高，W越大;当吸附温度为60 ℃时，温度刚好适宜， W达到最高为0.298 1%;当吸附温度大于60 ℃时，使得已吸附的总多酚被氧化，W减小.所以吸附温度60 ℃为最佳.

2.2   响应面优化实验设计

2.2.1  因素水平表

进行溶液pH值、吸附时间和吸附温度3个单因素实验，得到最佳吸附水平，根据相关实验结果，以实际提取率作為响应值，进行Box-behnken实验设计[22]，因素水平表见表2.

2.2.2   Box-behnken实验设计与结果分析

根据1.2.4、1.2.5和1.2.6节方法进行实验，结果见表3.

2.2.3   建立模型和分析显著性

利用Design expert 8.0软件进行相关数据的回归统计分析：吸附时间（A）、溶液pH值（B）和吸附温度（C）对火棘果总多酚提取率的二次多项式回归方程为：Y=0.24+1.38×10-4×A+2.69×10-4×B+3.18×10-4×C+1.05×10-3×A×B-1.28×10-3×A×C-1.24×10-3×B×C+2.81×10-4×A2-0.016×B2+1.17×10-3×C2.

方差分析和显著性检验结果见表4.

表4显示所选实验模型的显著水平为0.000 7，P<0.001，说明模型效果极显著，有实际意义，实验设计可靠;分析结果显示复相关系数R2=0.954 6，线性关系良好，说明回归模型与实际实验情况吻合程度较高;回归模型失拟差0.716>0.050，不显著，说明模型与实验值差异较小;从P值来看，二次项B2表现为极为显著，说明回归方程能较好地描述出单因素与树脂吸附火棘果总多酚量的关系，因此，分析得出预测的最佳工艺条件是比较正确的.

2.2.4   响应面的分析结果

3个因素的交互作用影响大小可根据回归模型分析得出，用Design expert 8.0软件进行拟合响应面形状，可以清晰地分析3个因素之间的交互作用，能更直观地分析交互作用之间对响应值的影响，结果见图5—图7.

响应面图的作用是：反映因素之间的交互影响大小，判断方法为：若图曲面陡峭则交互作用影响显著，反之则不显著.由图5、图6可知，两因素之间有交互作用影响;由图7可知，因素之间交互作用影响不显著，因为图中所示曲面平缓，与实验分析的结果（见表5）一致.吸附实验最佳条件用Design expert 8.0軟件预测得：在pH值4.94、吸附时间120 min、吸附温度70 ℃条件下，模型预测值为0.238 70%.

2.2.5   组合实验

将预测值稍微作一点调整，保证实验条件的实际可操作性和实验模型的合理性，用调整后的条件进行5次组合验证实验：pH值为5，吸附时间120 min，吸附温度70 ℃.结果见表5，可见模型优化后，预测结果是合理的，因为提取率只比模型预测值大0.006 02%.

3结论

研究了火棘果总多酚最佳提取工艺条件，以火棘果总多酚提取率为响应值，用D-101大孔吸附树脂分离火棘果总多酚，采用响应面优化，得出：在固液比1∶10（m（g）∶V（mL））、溶液pH值5、吸附时间120 min、吸附温度70 ℃的条件下，5次平行验证实验得出总多酚提取率与模型预测值相差0.006 02%，其值为0.244 72%;各因素对火棘果总多酚提取率的影响，可通过该回归方程真实地反映出来，且D-101大孔树脂不影响分离产物活性;该方法具有实验分离效果好、设备操作简单等优点.

在后续的实验中，将对其在医药或者保健上的功能进行研究.广西火棘果资源非常丰富，把火棘果发展成广西的特色产品，可拉动区域经济发展，因此，火棘果的研究和利用对于广西来说具有一定的价值.

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Optimization of the technological conditions for the separation of

total polyphenols from pyracanthophora fruit by macroporous resin

DENG Youlin， RAN Siyan， SU Huiren， LI Fangfang， ZHANG Peng， HUANG Xiuxiang

（School of Chemistry and Biological Engineering， Hechi University， Yizhou 546300， China）

Abstract： Taking the Pyracantha fortuneana （Maxim.） Li from Yizhou， Guangxi as the experimental material， the total polyphenols in the Pyracantha fortuneana （Maxim.） Li were extracted. The solvent used was an ethanol-water mixed solution. Based on the single factor experiment， the optimal process conditions for the separation of the total polyphenols from the Pyracantha fortuneana （Maxim.） Li for D-101 macro-porous resin were obtained by response surface optimization method and a mathematical model was established to study the factors affecting the extraction rate of total polyphenols from the fire spine fruit fortune： pH value of solution， adsorption time， adsorption temperature， and the significance and variance of the experiment were tested. It is concluded that the optimal conditions were adsorption time 120 min， solution pH=5， adsorption temperature 70 ℃ and the extraction rate of total polyphenols from the Pyracantha fortuneana （Maxim.） Li fortune was 0.244 72%. The predicted value of the model was 0.238 70%， and the combined experimental results were 0.006 02% less than the predicted value.

Key words： pyracantha fortuneana; macroporous resin; response surface method; total polyphenol;extraction technology

（責任编辑：罗小芬、黎   娅）

收稿日期：2020-10-23

基金项目：广西高校微生物及植物资源开发利用重点实验室开放课题（2018HL006）;大学生创新创业项目（202010605060）;河池学院2019

年校级项目（2019XJQN015）;广西自然科学基金项目（2018GXNSFAA138140）资助.

作者简介：邓佑林，硕士，讲师，研究方向：天然产物化学、有机化学，E?mail：461958538@qq.com.