刘东旭，沙万里,尹柏双,李国江*

(1.吉林农业科技学院，吉林 吉林 132101；2.吉林省教育厅预防兽医学吉林省重点实验室，吉林 吉林 132101)

猪圆环病毒(Porcine circoviruses，PCV)是一种无包膜的单链环状DNA病毒，可分为两大类：PCV1和PCV2。PCV1是20世纪70年从猪肾细胞中发现的与临床疾病无关的病毒。相反，PCV2与猪的一系列症状有关，称之为猪圆环病毒相关疾病(Porcine Circovirus Associated Disease，PCVAD)[1]。2016年，美国发现了一种新型圆环病毒-PCV3。研究表明，这种新出现的病毒与猪的急性心肌炎和多系统炎症的临床病例有关[2]。自PCV3在美国发现以来，我国也陆续在湖北、广东、河南、上海等多地发现PCV3[3]。鉴于PCV2过去对我国养猪业造成的巨大危害，PCV3一经发现就引起了我国研究学者的高度重视和密切关注，业界甚至普遍认为PCV3将是继PCV2之后未来几年内危害我国养猪业较为严重的传染病之一。为此，本研究对2017-2019年收集到的吉林部分地区10家规模化猪场的704份血清样品进行检测，进行PCV流行情况调查，较全面的了解吉林地区部分规模化猪场PCV的流行情况，为吉林地区PCV的预防和控制提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

病毒DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶(含10 x Buffer 25mmo1/LMCl2)、dNTP购自宝生物工程(大连)有限公司溴化乙啶(EB)、琼脂粉购自维特杰公司。

1.2 病料的收集

2017年1月至2019年12月期间，课题组收集吉林地区10家规模化猪场的血清样品704份。同时记录每份样品的基本信息，包括猪的体况、年龄及品种等。

1.3 方法

1.3.1 引物的设计与合成 根据GenBank中PCV2、PCV3保守区进行全基因组序列，合成4对引物，引物序列见表1，引物由长春库美生物工程有限公司合成。

1.3.2 PCV2、PCV3 DNA的提取及阳性率检测 按照Universal Genomic DNA Kit试剂盒操作说明书，从血清样品中提取病毒基因组DNA，用适量的TE溶解，-20 ℃，保存备用。应用设计的引物进行PCR的鉴定，PCR反应体系为：2×Ex Taq MasterMix 12.5 μL，上游引物、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 5.5 μL，总反应体系25 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 3min，95 ℃ 30s，退火30s(退火温度见表1)，72 ℃延伸45s，35个循环，72 ℃再延伸10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.3.3 PCV流行情况的数据统计分析 根据本研究对PCV的检测结果，统计分析2017-2019年吉林地区部分规模化猪场的PCV流行情况、日龄分布、发病季节及发病地区等情况，并应用统计学卡方检验分析结果相互间的显著性差异。

2 结 果

2.1 PCV PCR扩增结果

用PCR的方法对704份样品进行检测。样品的片段大小分别为330 bp和267 bp，与预期结果相符，结果如图1所示。

图1 样品PCR鉴定结果M.DL2000 DNA Marker；1.PCV2 PCR鉴定结果；2.PCV3 PCR鉴定结果Fig.1 PCR resultM.DL2000 DNA Marker;1.PCR results of PCV2;2.PCR results of PCV3

2.2 PCV混合感染结果

应用引物对704份样本提取的病毒基因组进行PCR鉴定，结果如表2所示。由表2可知，2017-2019年间PCV2的阳性率为42.0%(296/704)，PCV3阳性率为34.2%(241/704)，PCV2与PCV3混合感染率为22.7%(160/704)。且2018年和2019年PCV2的感染显著高于2017年(P<0.05)。

表2 吉林地区部分规模化猪场样品中PCV检测结果Table 2 Detection results of PCV in large-scale pig farms in some regions of Jilin Province

2.3 各季节PCV检测结果

根据样品PCV病原体的检测结果，对2017-2019年间，吉林地区部分规模化猪场PCV感染季节进行数据统计分析，结果如表3所示。PCV单独感染多发生在秋季：PCV2秋季感染率为48.4%(107/221)，PCV3秋季感染率为39.8%(88/221)。

表3 吉林地区部分规模化猪场PCV感染季节分布情况Table 3 Seasonal distribution of PCV infection in some large-scale pig farms in Jilin Province

2.4 各地区PCV检测结果

根据样品PCV病原体的检测结果，对2017-2019年间，吉林地区部分规模化猪场PCV感染主要疫情地区分布情况进行数据统计分析，结果如表4所示。由表4可知，中部地区是PCV单独感染及混合感染主要地区，该地区PCV2感染率为56.4%(115/204)，PCV3感染率分别为43.1%(88/204)，混合感染感染率为29.4%(60/204)，感染率显著高于其他地区(P<0.05)。

表4 吉林地区部分规模化猪场PCV感染主要疫病地区分布情况Table 4 Distribution of PCV infection in some large-scale pig farms in Jilin Province

2.5 不同年龄猪PCV检测结果

根据样品PCV病原体的检测结果，对2017-2019年间，吉林地区部分规模化猪场PCV感染不同生长阶段分布情况进行数据统计分析，结果如表5所示。由表5可知，PCV2在仔猪中感染率较高，为49.7%(96/193)，而PCV3及PCV2+PCV3混合感染在不同年龄段中的猪群中感染率没有显著差异(P>0.05)。

表5 吉林地区部分规模化猪场PCV感染不同生长阶段分布情况Table 5 Distribution of PCV infection in different growth stages of some large-scale pig farms in Jilin Province

3 讨 论

PCV3是2016年美国新发现的一种病毒。自PCV3发现以来，已经在巴西、中国、波兰和韩国等多个国家检测到PCV3的存在[4]，且该病毒从出现猪皮炎与肾病综合征、流产仔猪以及患断奶仔猪多系统衰竭综合征的断奶仔猪体内分离得到，而PCV2检测为阴性，这提示PCV3可能为导致猪皮炎与肾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭综合征以及繁殖障碍的病原之一。由于PCV2对养猪业造成了很大的经济损失，故学者们对这个新出现的PCV3更为重视。为此本研究对课题组收集到的，2017-2019年吉林地区部分规模化猪场的704血清样本进行PCV病原学检测，较全面的了解吉林地区部分规模化猪场PCV的流行情况，为吉林地区PCV的预防和控制提供数据参考。

从检测数据可以看出，吉林地区PCV2与PCV3的混合感染率为22.7%(160/704)，虽然低于湛洋等[5]2014年对湖南、江苏、湖北的调查结果(PCV3+PCV2为42.9%)，但高于时庆贺等[6]、赵宇等[7]、葛非非等[8]对河南、上海、四川的调查结果。结果虽然显示各地PCV的流行情况均不相同，但表明PCV已在我国广泛流行。本研究结果显示，PCV3的感染率在2017-2019各年份之间没有显著差异，虽然与郭影成等对吉林省2015-2017年的PCV3调查结果不尽相同(2015-2017年PCV3感染率逐年上升)[9]，但均可以说明吉林省猪场已普遍存在PCV3，且PCV2和PCV3不具有交叉免疫保护的特点，现有的PCV2疫苗无法对PCV3的感染提供保护，从而导致PCV3在猪场内大规模感染，因此实时监测PCV2和PCV3的感染情况，强化生物安全，加强饲养管理，改善猪场环境，控制营养结构尤为重要。

与2017年相比，2018年及2019年PCV2的感染率显著上升(P<0.05)。且PCV2在仔猪中感染率较高，为49.7%(96/193)。分析原因，一方面由于PCV2除了可以水平传播外，还可以通过精液和胎盘进行垂直传播，并且PCV2在母猪群中隐性感染，导致该病毒通过胎盘传播给仔猪，从而导致仔猪感染率升高。另一方面猪场环境中存在PCV2，而猪场对于猪舍等环境消毒未到位，导致其感染率上升。对2017-2019年间，吉林地区部分规模化猪场PCV感染季节进行数据统计分析，发现PCV单独感染多发生在秋季，而与贺会利对广西地区的PCV流行情况不同(夏季为主要感染季节)[10]，分析原因由于地区不同，猪场所处的气候、温度、湿度也不尽相同，从而导致病毒在不同地区的高发季节不同。且根据本实验室多次对猪疾病流行情况调查发现，吉林中部地区一直为猪病病原体高感染率地区，表明中部地区应加强对猪群的饲养管理，必须以预防为主，采取综合性防治措施，将猪病的危害降低至最小。