叶子，商智勋，李美奇，任洪冰，屈用函，胡小松,2，易俊洁*

1(昆明理工大学 农业与食品学院，云南 昆明，650500)2(中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京，100083) 3(云南宏斌绿色食品集团有限公司，云南 玉溪，651100)4(云南省文山州农业科学院辣椒作物研究所，云南 文山，663000)

小米辣(CapsicumfrutescensL．)是我国唯一的野生辣椒资源，属于茄科辣椒属1年生(冷凉地区)或多年生(热区)灌木状辣椒，花果直立或侧生，果实通常呈短指形或长指形，少部分果实呈米粒状(雀辣)[1-2]。小米辣作为加工型辣椒品种，是云南特色发酵辣椒(即泡椒)产品的主要原料。经过自然发酵后的小米辣，具有黄绿色的外观、爽脆的口感、柔和的辣度、独特的风味以及丰富的VC[3]、辣椒碱[4]等生物活性成分，深受西南地区乃至全国消费者的喜爱，并不断出口到韩国、日本和新加坡等国家[5]。目前，发酵小米辣已广泛应用于菜肴烹调、配菜佐料、辛辣副食品调料等产业，成为了泡椒凤爪和泡椒牛肉方便面等许多即食方便食品不可或缺的特色配料[5]。

云南小米辣栽培历史悠久，品种丰富，在科技部“云南及周边地区农业生物资源调查”项目调查的31个县中，共收集到小米辣资源59份，包含了栽培种、半野生种、野生种等，云南已成为全国小米辣遗传多样性和生态多样性的中心[2]。然而，目前针对云南小米辣品种对发酵产品品质的影响研究鲜见报道，缺乏系统的研究。因此，本研究基于云南丰富的小米辣种质资源，以具有代表性的9个小米辣品种为研究对象，系统地分析了不同品种发酵小米辣的品质特性，并采用多元数据分析技术，综合评价了品种对发酵小米辣品质差异的影响，为云南发酵辣椒产业的原料选择提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

9个不同品种的小米辣原料由云南省文山州农业科学院辣椒研究所提供，分别为文米辣5号(1)、文米辣4号(2)、文米辣9号(3)、文米辣3号(4)、文赏椒1号(5)、文赏椒2号(6)、文米辣6号(7)、文米辣8号(8)和文米辣7号(9)，其中新鲜小米辣以X表示，发酵小米辣(泡椒)以P表示，具体样品信息如表1所示。采摘后的新鲜小米辣由砚山云辣农业科技有限公司贮存，小米辣洗净后与氯化钠、冰醋酸、柠檬酸及氯化钙充分混合，然后置于泡菜坛中自然发酵3个月后进行品质指标测定。所有样品均密封包装并于4 ℃保存(图1)。

表1 样品采集基本信息表Table 1 Information collection of samples

天然辣椒碱、二氢辣椒碱、抗坏血酸、G250考马斯亮蓝(4 ℃保存)，阿拉丁(中国，上海)；色谱级乙腈、乙酸和乙醇，Sigma-Aldrich(米兰，意大利)；type-H标准氨基酸溶液，Wako(Wako-shi，日本)；食品级氯化钠、冰醋酸、柠檬酸、氯化钙，湖南晴天生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。

a-新鲜辣椒(小米辣);b-发酵辣椒(泡椒)图1 不同品种的新鲜小米辣和发酵小米辣Fig.1 Different cultivars of fresh and fermented Xiaomila

1.2 仪器与设备

FE28型pH计，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；UV-6100S型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；SB-5200DT型超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；CR-400色彩色差计，日本Konica Minolta公司；TA-XT.Plus质构仪，英国Stable Micro System公司；Agilent 1200高效液相色谱仪、TC-C18柱，美国Agilent公司；L-8900全自动氨基酸分析仪、#2622PH柱，日本Hitachi公司。

1.3 pH值、可滴定酸及亚硝酸盐含量测定

将样品均质后称重，测定了不同发酵小米辣样品的pH值、可滴定酸和亚硝酸盐含量。将10 g的样品匀浆与90 mL去离子水混匀，过滤后采用pH计测定滤液的pH值。可滴定酸采用酸碱滴定法测定，取10 g样品匀浆加蒸馏水定容到100 mL，过滤后用0.1 mol/L 氢氧化钠标准液滴定滤液pH值至8.1，记录消耗氢氧化钠溶液的体积，可滴定酸结果以乳酸含量计。亚硝酸盐含量按GB 5009.33—2016[6]测定。所有测量均进行了3次。

1.4 色泽、叶绿素和类胡萝卜素含量测定

采用CR-400色度计(D 65，观测角度2°)测定小米辣和发酵小米辣样品的表面颜色[7]。为尽量避免测定误差，每个辣椒样品检测3次，每个品种随机选择10个辣椒样品进行测定。亮度L*、红绿度a*和黄蓝度b*被用来描述样品的颜色，并按照公式(1)计算色差(ΔE*)。

(1)

式中：“0”和“x”分别代表新鲜样品和发酵样品。

叶绿素含量和类胡萝卜素总量参照LUO等[8]的描述进行测定。

1.5 质构测定

采用配有P1/s探头的TA-XT.Plus质构仪进行2次压缩测定辣椒的硬度和咀嚼度[9]。选择尺寸相近辣椒样品的中部位置进行质构测定。测试条件如下：测前、测试、测后速度均为2.0 mm/s，压缩比例75%，时间5.0 s，触发力5.0 g。所有测量均进行20次。

1.6 辣椒碱含量测定

辣椒样品在60 ℃下干燥3 d后打粉，称取2 g干燥样品与15 mL甲醇混合，利用超声辅助提取辣椒碱[9]。超声处理的条件为：温度50 ℃；输出振幅65% (200 W)；提取时间15 min。提取液过滤后过0.45 μm滤膜，进样分析。

采用HPLC于280 nm下测定辣椒碱含量。色谱柱为TC-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流动相分别为0.1%(体积分数)甲酸-水(流动相A)和乙腈(流动相B)，流动相梯度为：0 min，45% B；25 min，65% B；30 min，100% B；35 min，45% B。进样量为20 μL，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃。采用外标法计算样品中辣椒碱和二氢辣椒碱的含量并根据公式(2)计算斯科维尔指数(scoville heat units，SHU)。每个样品均进行3次平行实验。

SHU=W×0.9×(16.1×103)+W×0.1×(9.3×103)

(2)

式中：SHU，斯科维尔辣度指数；W，辣椒碱总量，mg/g。

1.7 游离氨基酸含量测定

游离氨基酸提取参照尹小庆等[10]的方法，并稍作修改。取样品匀浆(0.5 g)与10 mL磺基水杨酸溶液(10 g/L)混合，在室温下放置1 h，10 000 r/min离心15 min，收集的上清液过0.45 μm滤膜待测。

氨基酸自动分析仪条件：阳离子交换柱(#2622PH，4.6 mm×60 mm，3 μm)。流动相为PH-1、PH-2、PH-3、PH-4、PH-RG、茚三酮溶液、茚三酮缓冲溶液、5%(体积分数)乙醇、HPLC级水。柱温50 ℃，通道1流速0.4 mL/min，通道2流速0.35 mL/min。紫外检测器分别在570 nm下(VIS 1)检测天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、半胱氨酸和在440 nm下(VIS 2)检测脯氨酸。采用标准氨基酸混合物(type-H)计算各游离氨基酸的含量。每个样品均进行3次平行实验。

1.8 VC含量测定

按照YI等[11]的描述测定了样品中总VC、抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量。称取5 g样品匀浆与30 mL提取缓冲(10 g/L偏磷酸和5 g/L草酸，pH=2.0)，振荡混匀1 min，然后在4 ℃下，14 000 r/min离心30 min。收集上清液并调节pH值至3.5。将上一步提取液分为2部分，一部分加入2 mL磷酸缓冲液(20 mmol/L NaH2PO4和1 mmol/L Na2EDTA, pH=3.5)来测定抗坏血酸含量，另一部分加入2 mL还原剂(2.5 mmol/L 三羧基乙基膦磷酸缓冲液，pH=3.5)来测定总VC。提取液与缓冲液体积比均为1∶2。2种混合物均在4 ℃下10 000 r/min离心10 min 后取上清液过0.45 μm滤膜，进样分析。

色谱条件：Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，紫外检测器设置为245 nm。流动相A为1 mmol/L Na2EDTA和10 mmol /L CH3COONH4，pH值为3.0，流动相B为甲醇。95% A等度洗脱15 min。进样量为25 μL，流速为0.8 mL/min，柱温为20 ℃。采用外标法计算样品中VC和抗坏血酸，脱氢抗坏血酸含量等于总VC含量减去抗坏血酸含量。每个样品均进行了3次提取及测定。

1.9 数据分析

试验所得数据均以平均值±标准差表示，采用Tukey单因素进行方差分析(P<0.05)，均用Origin 2020进行数据处理。采用Solo 6.5(Eigenvector Research，USA)软件进行多元数据分析。以所有获得的品质指标为X变量，发酵前后的辣椒品种为Y变量进行偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)。通过计算变量鉴定系数(variable identification，VID)筛选出新鲜小米辣和发酵小米辣样品的特征性品质指标。

2 结果与分析

2.1 pH值、可滴定酸及亚硝酸盐含量

由表2可知，品种对发酵小米辣的pH值和可滴定酸值影响不明显，不同品种的发酵小米辣样品pH值在3.02～3.20，平均值为3.12；可滴定酸值变化范围为1.13%～1.37%，平均值为1.25%。

表2 不同发酵小米辣样品的pH值、可滴定酸含量和亚硝酸盐含量Table 2 pH, titratable acid and nitrite content in different Paojiao samples

亚硝酸盐是衡量发酵蔬菜安全性的重要指标之一，亚硝酸盐可在胃酸作用下与蛋白质分解产物二级胺反应生成亚硝胺，亚硝胺是强致癌物，可致食管癌、胃癌、肝癌和大肠癌等，对人体健康造成极大威胁[12]。GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》和NY/T 437—2012《绿色食品酱腌菜》均对蔬菜及其制品(腌渍蔬菜)的亚硝酸盐含量进行了规定，分别要求不得超过20和4 mg/kg[13-14]。经过3个月的自然发酵，不同品种的发酵小米辣的亚硝酸盐含量为1.45～3.96 mg/kg，均属于安全范围内。

2.2 色泽及叶绿素、类胡萝卜素含量

果实外观色泽是发酵辣椒制品重要的品质特性之一，直接影响消费者的购买欲望。发酵前后小米辣的外观颜色观察和颜色指标(L*值、a*值、b*值、ΔE*值、叶绿素含量和类胡萝卜素总量)分别如图1和图2-a～图2-f所示。鲜辣椒的L*值、a*值和b*值分别为64.09～74.04、-11.30～-3.14和31.43～43.29，X6的L*、a*和b*值最大，且X6是唯一1个经发酵后a*值降低的样品，表明X6经发酵后红度降低，绿度增加。对于发酵小米辣样品来说，L*值、a*值、b*值分别为61.06～69.32、-6.62 ～-4.02和44.26～52.20。由图1和图2可知，发酵后，小米辣的亮度和绿度显著降低，黄度增大，ΔE*值均高于6.00，表明发酵过程使得小米辣从嫩绿色变为黄色，出现显著的颜色变化[15]。相比之下，X5和X6经发酵后的ΔE*值较其他样品小，表明X5和X6的颜色变化不如其他样品明显。

辣椒果实的颜色主要由叶绿素、类胡萝卜素和类黄酮类化合物的种类和含量决定[16]。青椒果实中含有丰富的叶绿素，叶绿素的种类及其含量使辣椒呈现独特的绿色，同时也提供了一定的抗氧化活性[17]。类胡萝卜素是含40个碳的类异戊烯聚合物，具有多重共轭双键，这种共轭双键使类胡萝卜素能够吸收可见光产生黄色、橙色和红色，赋予水果、鲜花和蔬菜鲜艳的颜色[18]。类黄酮是大多数橙色、鲜红色、紫色和蓝色来源，也有助于黄色的形成[19]。辣椒品种间叶绿素、类胡萝卜素和类黄酮含量的不同导致不同品种小米辣之间显著的颜色差异。由图2可知，发酵后不同品种小米辣中的叶绿素含量降低，类胡萝卜素增加。发酵过程是一个高酸环境，极易发生叶绿素的降解。酸性条件下，叶绿素分子卟啉环中的镁离子被取代形成脱镁叶绿素，脱镁叶绿素的形成伴随着从亮绿色到橄榄棕色的颜色变化，从而降低了辣椒的亮度和绿度[20]。叶绿素降解的同时一些发酵微生物使得类胡萝卜素含量增加，辣椒变黄。

a-L*值；b-a*值；c-b*值；d-ΔE*值；e-叶绿素含量；f-类胡萝卜素含量；g-硬度；h-咀嚼度图2 不同品种小米辣和发酵小米辣样品的颜色和质构品质指标Fig.2 Color and texture parameters of different Xiaomila and Paojiao samples注：不同字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

2.3 质构

云南发酵小米辣以整个辣椒食用为主，硬度和咀嚼度是评价其口感的重要指标。小米辣发酵前后的硬度和咀嚼度如图2-g～图2-h所示。不同品种小米辣的硬度和咀嚼度存在显著差异：硬度为6.46～44.79 N，咀嚼度为4.00～24.57 N，其中X5的硬度和咀嚼度最高，其次是X6和X8。经过发酵处理后，小米辣的质构指标均显著降低，其中硬度降至1.87～12.92 N，咀嚼度降至1.69～6.57 N，P5的硬度和咀嚼度依旧最高。发酵过程中的微生物可以通过代谢过程改变体系环境而影响组织细胞壁状态，还可以通过产生果胶降解酶系来降解植物细胞壁成分，从而降低辣椒的硬度和嚼劲[20]。

2.4 辣椒碱含量

辣度是影响发酵小米辣口感的重要指标之一，辣度的形成与辣椒碱的种类和含量密切相关。小米辣中辣椒碱主要由天然辣椒碱和二氢辣椒碱组成，约占辣椒碱总量的90%，通常通过测定它们的含量来表征辣椒碱的总量[9]。天然辣椒碱和二氢辣椒碱混标及样品中辣椒碱的色谱图如图3-a～图3-b所示。另外，本研究还计算了SHU值，以直观表征小米辣整体的辛辣度。辣椒碱、二氢辣椒碱含量和SUH值分别如图4-a～图4-c所示。不同品种小米辣的辣度差异显著，且天然辣椒碱含量均显著高于二氢辣椒碱(P<0.05)。新鲜小米辣样品中天然辣椒碱含量为0.43～6.90 mg/g，二氢辣椒碱含量为0.19～3.44 mg/g，SHU值为10 693～177 735。X5和X6的辣椒碱含量远低于其他样品，X9中天然辣椒碱和二氢辣椒碱的含量均最高。对比常晓轲等[22]的研究可知，除X5和X6外，其余样品辣度级别均高于8，辣度较高，不宜直接食用。发酵后的小米辣辣度显著降低(P<0.05)，其中天然辣椒碱的含量为0.24～6.19 mg/g、二氢辣椒碱为0.13～3.15 mg/g、SHU值为6 438～160 484。辣椒碱类物质呈碱性，在发酵的高酸环境中被中和，含量明显降低。因此发酵可以改变辣椒碱的含量，从而提供更柔和、更诱人的香气，使发酵小米辣产品更易被消费者接受[23]。

2.5 游离氨基酸含量

发酵蔬菜富含游离氨基酸，不仅可以为人体健康提供必需氨基酸，其中呈味氨基酸还是发酵蔬菜的重要风味物质，可以有效增强产品的风味和口感[10]。本研究对样品中主要的17种游离氨基酸进行了分析，其中包括鲜味氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)、甜味氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸)和苦味氨基酸(精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和缬氨酸)[8]。氨基酸混标及样品中氨基酸的色谱图如图3-c～图3-d所示。

所有样品中均检测到了17种游离氨基酸，各类氨基酸的含量如图5所示。鲜辣椒X1中的游离氨基酸总量、鲜味和甜味氨基酸含量均最高，分别为176.24、48.76 和52.70 mg/100g。X8中检测到了最高含量的苦味氨基酸，为77.82 mg/100g。X4中游离氨基酸总量、鲜味、甜味、苦味氨基酸的含量均最低。发酵后不同品种辣椒中的氨基酸含量均有不同程度的增加。P1中游离氨基酸总量、鲜味和苦味氨基酸的含量最高，P2中的甜味氨基酸含量最高。发酵后P4中的游离氨基酸总量、鲜味和苦味氨基酸的含量依旧最低。

发酵后的游离氨基酸含量均呈现增加的趋势。在所有样品中，组氨酸是唯一经发酵后含量降低的游离氨基酸。发酵过程中，由于微生物和内源蛋白酶的作用，部分蛋白质不断被分解为肽类和多种游离氨基酸，从而含量增加[24]。鲜辣椒中苦味氨基酸含量最高，其次是甜味和鲜味氨基酸。发酵后甜味氨基酸含量明显增加，达到最高，其次是苦味和鲜味氨基酸。鲜味是发酵小米辣特殊风味形成的重要风味成分，其含量虽然不是最高的，但天冬氨酸和谷氨酸因其较低的风味阈值(分别为3、5 mg/100g)，对新鲜小米辣和发酵小米辣的鲜味及酸味贡献最大[25]。

2.6 VC含量

VC作为一种抗氧化活性物质，其在抗氧化、解毒、预防癌症等方面的健康益处已得到广泛证实[3]，但VC极其不稳定，在加工过程容易出现降解，从而因功能活性降低导致辣椒品质下降。抗坏血酸标品和样品中抗坏血酸、总VC的色谱图如图3-e～图3-f所示。由图4-d～图4-f可知，新鲜小米辣中抗坏血酸为主要活性成分，含量为82.16～124.68 mg/100g，脱氢抗坏血酸含量相对较低(3.02～12.59 mg/100g)，抗坏血酸的含量显著高于脱氢抗坏血酸。最高含量的抗坏血酸和脱氢抗坏血酸分别在X2和X8中检出，抗坏血酸和脱氢抗坏血酸含量最低的分别为X7和X9，X2中VC的含量最高，X7中VC的含量最低。经过发酵处理以后，不同品种的抗坏血酸、脱氢抗坏血酸和总VC含量均出现下降趋势，但对于脱氢抗坏血酸来说，抗坏血酸含量降低的程度显著高于脱氢抗坏血酸。这可能是因为在有氧条件下，抗坏血酸很容易转化为脱氢抗坏血酸，脱氢抗坏血酸非常不稳定，在持续的氧化条件下，进一步降解为2,3-二酮古洛糖酸。抗坏血酸因温度、pH值、光照、酶或氧的存在等多种因素而发生降解，使得发酵后抗坏血酸的含量显著降低[11]。发酵后的P2样品中抗坏血酸和总VC含量最高,P5中的抗坏血酸和总VC含量均最低。

a-辣椒碱混标色谱图；b-样品辣椒碱色谱图；c-氨基酸混标色谱图；d-样品氨基酸色谱图；e-抗坏血酸色谱图；f-样品抗坏血酸色谱图图3 辣椒碱、氨基酸、抗坏血酸标品和样品色谱图Fig.3 Chromatograms of capsaicin standard, free amino acid, ascorbic acid standard and sample

a-天然辣椒碱含量；b-二氢辣椒碱含量；c-SHU指数;d-抗坏血酸含量；e-脱氢抗坏血酸含量；f-总VC含量图4 不同品种小米辣和发酵小米辣样品的辣椒碱和VC含量Fig.4 Capsaicinoids and VC contents of different Xiaomila and Paojiao samples

a-游离氨基酸总量；b-鲜味游离氨基酸含量；c-甜味游离氨基酸含量；d-苦味游离氨基酸含量图5 不同品种小米辣和发酵小米辣样品的游离氨基酸总量及呈味氨基酸的含量Fig.5 The content of total free amino acid and free amino acid with taste characteristic in Xiaomila and Paojiao samples

2.7 多元数据综合分析

为了综合评价品种和发酵处理对小米辣品质特性的影响，本研究结合新鲜小米辣和发酵小米辣所有品质指标进行了综合多元数据分析，如图6所示，新鲜小米辣和发酵小米辣样品显著分开，说明发酵显著改变了小米辣的品质特性。另外，LV1的Y变量(94%)，也表征了新鲜小米辣和发酵小米辣品质特性存在显著差异。新鲜样品中X5与X9相距较远且与其余样品两两分离，表明二者与其余样品的品质存在显著差异。另外X2与X1相距较近且部分重叠，二者的品质最为接近，X3、X4、X6和X7较为集中，品质较为相似。由图6可知，发酵后样品间的品质差异与新鲜样品不同，P2与P7在品质上最为接近。从样品分布也可以看出，发酵后的小米辣样品分布比新鲜样品更紧凑，说明发酵在一定程度上减弱了辣椒品种对品质的影响。

图6 小米辣和发酵小米辣品质参数的PLS-DA bi-plot分析Fig.6 PLS-DA bi-plot of quality parameters for Xiaomila and Paojiao注：实心图标代表新鲜小米辣样品，空心图标代表发酵小米辣样品

为了进一步定量分析发酵前后不同品种小米辣品质特性与样品的相关性，计算VID，并以|VID|≥0.700为判定标准筛选出表征性品质指标。在新鲜小米辣组筛选出2个特征性品质指标，即总VC(VID=0.918)和抗坏血酸(VID=0.905)。发酵小米辣中有6个特征品质指标被筛选出，分别是游离氨基酸总量(VID=-0.928)、甜味氨基酸(VID=-0.915)、鲜味氨基酸(VID=-0.888)、b*(VID=-0.872)、a*(VID=-0.778)和苦味氨基酸(VID=-0.752)，说明发酵处理显著促进小米辣的风味形成，但同时也使得色泽发生变化、VC显著降低。发酵后筛选出的特征性品质指标(特别是游离氨基酸总量、鲜味氨基酸和甜味氨基酸)多集中靠近于P1，表明P1的风味更为丰富。

3 结论

本研究对不同品种小米辣发酵前后的品质特性进行了综合评价。研究表明，品种对发酵小米辣品质影响显著，且发酵前后各品种小米辣的品质特性发生变化。发酵处理后，小米辣的总VC和抗坏血酸含量显著降低，色泽从绿色向黄绿色转变，且硬度降低，但是发酵使得小米辣的辣度变得更柔和，且呈味氨基酸含量显著增加，形成了发酵特有的口感和风味。

尽管不同品种小米辣表现出不同品质特性，但通过多元数据分析发现，发酵在一定程度上减弱了辣椒品种间的差异，也就是说发酵诱导不同小米辣的品质出现同质化的趋势。综合比较发现，文赏椒(P5和P6)的硬度高且辣度低，可作为高硬度、低辣度发酵辣椒新产品的加工原料；P1辣度和硬度适中、VC含量较高，最重要的是呈味氨基酸含量高，由于风味对发酵辣椒品质的影响最显著[9]，基于此，认为文米辣5号(P1)可能最适合传统发酵小米辣产品的加工。