王媛媛，李红玲

（1.甘肃中医药大学临床医学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院肿瘤内科，甘肃 兰州 730000）

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，按组织学类型主要分为食管鳞癌和食管腺癌两种，我国以食管鳞癌为主，而欧美国家以食管腺癌为主。食管癌的首选检查方法为上消化道内镜检查，治疗方式是以外科手术治疗为主的综合治疗，目前的分期标准采用国际抗癌联盟（UICC）及美国癌症联合会（AJCC）联合发布的第八版食管及食管胃交界部癌TNM分期标准[1]。食管癌作为我国常见的消化道恶性肿瘤，近年来的发病率呈上升趋势，因其早期无明显临床症状，且缺乏特异性分子标记物，多数患者确诊时已是中晚期，预后差。现有大量研究表明氧化应激在恶性肿瘤的发展中起重要作用，而Nrf2/ARE信号通路作为氧化应激中的关键通路之一，近年来备受研究者关注。研究主要探讨了此信号通路所激活的GCLM和GPX4两种蛋白在食管鳞状上皮细胞癌（ESCC）中的表达情况及其临床病理特征间的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料

实验所需标本来源于甘肃省人民医院收治的2019年4月-2020年4月的食管鳞癌患者50例，临床资料完整，入院前均未进行放、化疗。其中男性39例，女性11例，年龄43-81岁，中位年龄65岁。鳞状上皮细胞高分化7例、中低分化43例，TNM临床分期Ⅰ-Ⅱ期16例，Ⅲ-Ⅳ期34例，同时取20例健康志愿者正常食管组织，其中男性14例，女性6例。研究的所有患者均签署知情同意书，并获得甘肃省人民医院伦理委员会批准。

1.2 方法

采用免疫组化SP法，操作过程严格按照试剂盒说明书进行，试剂GCLM（ab126704）购于艾博抗（上海）贸易有限公司，GPX4（ab125066）购于艾博抗（上海）贸易有限公司。将石蜡标本切片，厚度4μm，常规脱腊、水化、修复，滴加3%H2O2室温孵育25min以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗3次，每次3min，滴加正常山羊血清，室温下封闭30min，倾去血清，滴加一抗（1:400），放入冰箱4℃过夜，滴加生物素标记的羊抗兔IgG室温孵育50min，PBS冲洗3次，每次3min，DAB显色，苏木素复染，自来水冲洗，脱水，透明，晾干，封片，置于显微镜下观察分析。结果判定：每张切片随机选取5个高倍镜视野，由两位经验丰富的病理科医生采用双盲法进行阅片。阳性结果以阳性细胞数得分与染色强度得分的乘积为判定标准，以细胞质或细胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性染色。按阳性细胞数分：≤5%为0分、6%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、＞75%为4分，按染色强度分：无着色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。将两项结果相乘：0分为阴性（-）、1～4分为弱阳性（+）、5～8分为阳性（++）、9～12分为强阳性（+++）。

1.3 统计学分析

采用SPSS22.0软件进行分析，计数资料采用χ2检验，GCLM与GPX4的相关性采用Spearman等级相关性分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化法检测GCLM、GPX4在ESCC中

的表达

GCLM和GPX4的阳性表达主要位于细胞质，少量位于细胞核，呈黄色或棕黄色颗粒（如图1、2所示），GCLM在ESCC中的阳性表达率为84%（42/50）高于其在正常食管组织中的表达率45%（9/20），GPX4在ESCC中的阳性表达率为82%（41/50）高于其在正常食管组织中的表达率25%（5/20），差异具有统计学意义（P=0.001＜0.05，见表1；P=0.000006＜0.05，见表2）。

表1 GCLM在ESCC和正常食管组织（对照组）中的表达 n（%）

表2 GPX4在ESCC和正常食管组织（对照组）中的表达 n（%）

图1 免疫组化法检测GCLM的表达（SP法×200）

2.2 GCLM、GPX4的表达与ESCC患者临床病理特征的关系

GCLM的表达与患者年龄、性别无关，与肿瘤分化程度、淋巴结转移情况及临床分期有关，GPX4的表达与患者年龄、性别无关，与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移情况及临床分期有关，差异具有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

表3 GCLM和GPX4与ESCC患者临床病理特征的关系

图2 免疫组化法检测GPX4的表达（SP法×200）

2.3 ESCC组织中GCLM与GPX4表达间的关系

根据Spearman相关性分析，ESCC患者中的GCLM表达与GPX4表达呈正相关（r=0.506，P=0.000181＜0.05，见表4）。

表4 GCLM与GPX4在ESCC中阳性表达的关系

3 讨论

3.1 Nrf2/ARE信号通路

此通路为氧化应激中的关键通路，机体在正常生理状态下Nrf2（核转录因子E2相关因子2）与Keap1（Keleh样环氧氯丙烷相关蛋白1）结合存在于细胞胞浆中，维持氧化还原平衡。当细胞受到亲电子物质或ROS（活性氧）刺激，即发生氧化应激时，Nrf2与Keap1解偶联进入细胞核，并与ARE（抗氧化反应元件）结合，从而激活下游一系列抗氧化酶及解毒酶的表达，如GCL（谷氨酰半胱氨酸链接酶）、NQO1（醌氧化还原酶1）、HO-1（血红素加氧酶1）、GPX(谷胱甘肽过氧化物酶)等，它们可以清除体内多种致癌物质及毒性物质，从而保护机体免受侵害，维持机体内环境稳定，起到抗癌、解毒等作用。此外Nrf2/ARE信号通路还具有抗炎、抗凋亡、抗动脉粥样硬化、保护神经系统等作用[2,3]。

3.2 GCLM

GCLM与GCLC（谷氨酰半胱氨酸链接酶催化亚基）结合形成GCL。GCL原被称为γ 谷胺酰半胱氨酸合成酶，由轻、重两条链组成，轻链即GCLM，重链即GCLC。GCL与GSH（谷胱甘肽）的合成有关，GSH是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸缩合而成的肽类物质，存在于机体细胞中，以胞浆中含量最多，GSH作为抗氧化剂可保护机体免受氧化应激的损害，在抗肿瘤、增强免疫力等方面发挥重要作用。研究表明[4,5]增加GCL活性可提高细胞内GSH的含量，但当GSH含量过多时又会抑制GCL的表达，而GCLM对GCL的功能起着重要的调控作用，GCLC是GSH的反馈抑制点，所以当细胞受到氧化应激刺激需要合成大量GSH时，GCLM可与GCLC结合从而消除GSH引起的反馈抑制。Botta等[6]发现GCLM基因敲除小鼠的GSH含量降低，Brooke等[7]发现GCLM基因敲除雌性小鼠的受精卵着床会受干扰。Mougiakakos等[8]研究表明GCLC的高水平表达可使肿瘤细胞内的ROS含量降低，从而降低肿瘤细胞的增殖速度，Soini Y等[9]研究表明GCLC、GCLM在非小细胞肺癌组织中高表达。研究发现食管鳞癌组织中的GCLM表达水平明显高于正常食管组织，GCLM在食管癌中、低分化组的阳性率为90.6%（39/43）明显高于高分化组42.8%（3/7），在淋巴结远处转移组中的阳性率为100%（21/21）明显高于无淋巴结转移组72.4%（21/29），在临床分期Ⅲ-Ⅳ期组的阳性率为94.1%（32/34）明显高于Ⅰ-Ⅱ期组62.5%（10/16），此数据表明GCLM的表达水平与食管癌临床分期及恶性程度成正相关。

3.3 GPX4

GPX4属GPX的8种分型即GPX1-GPX8之一，GSH的抗氧化作用主要通过GPX催化完成。有学者通过尝试去除小鼠的GPX4基因，结果其在胚胎早期就会死亡，证明GPX4基因与机体存活有重要关系[10]。GPX4分为核型、胞质型、线粒体型，不同类型的GPX4分布于机体不同组织细胞的胞核、胞质及线粒体中，GPX4可保护线粒体免受ROS刺激，防止线粒体凋亡，还能还原磷脂及胆固醇氢过氧化物，使机体免受氧化应激损伤，防止心血管疾病及神经退行性变发生[11]。贾忠伟等[12]发现GPX4在肺腺癌组织中的表达水平高于正常组织，Guerriero等[13]研究表明GPX4在肝癌组织中高表达，且表达水平与组织分级呈正相关。研究发现GPX4在食管鳞癌组织中的表达水平明显高于正常食管组织，GPX4在浸润深度为外膜及外周器官组的阳性率为93.5%（29/31）明显高于浸润深度为黏膜层及肌层组63.1%（12/19），在淋巴结远处转移组中的阳性率为100%（21/21）明显高于无淋巴结转移组68.9%（20/29），在临床分期Ⅲ-Ⅳ期组的阳性率为94.1%（32/34）明显高于Ⅰ-Ⅱ期组56.2%（9/16），此数据表明GPX4表达水平与食管癌临床分期及恶性程度成正相关。

综上所述，通过检测GCLM和GPX4在食管鳞癌中的表达及其临床病理特征间的关系，并对GCLM和GPX4表达水平间的相关性进行分析，提示Nrf2/ARE信号通路在食管癌的发展中起重要作用，Nrf2所激活的GCLM和GPX4与食管癌的发生、发展及转移密切相关，可作为食管癌检测的标志物，为其临床诊断提供参考价值。