徐 磊 戴玉淇 王 心 许 欢 高 珊 陈晓明

(淮阴工学院生命科学与食品工程学院，淮安 223003)

薏米又名薏苡仁、六谷米等，禾本科，一种典型的药食两用资源，享有“禾本科之王”的美誉。薏米中不仅含有丰富的脂肪、蛋白质[1]、膳食纤维[2]，还含有大量的多酚[3]、黄酮[4]、谷甾醇[5]等生物活性成分。传统医学认为薏米具有滋补、润肤、祛湿、消痛等功效[5]。近年来的研究还表明，薏米具有抗炎[6]、抗肿瘤[7]等多种药理活性。

菌酶协同发酵即在微生物发酵的同时加入一定量的蛋白酶、碳水化合物酶等酶制剂，可克服单一利用微生物发酵产酶不足的问题，现已在功能食品、生物饲料等行业得到广泛的应用[8, 9]。姚晓红等[10]研究发现菜籽粕经枯草芽孢杆菌和中性蛋白酶协同发酵后，其硫代葡萄糖苷、单宁和植酸的含量显著降低，而多肽、钙和磷的含量显著提高。本课题组前期试验结果表明，蛋白酶协同发酵可显著提高脱脂薏米水提取液中生物活性成分含量，增强其功能活性[11]。碳水化合物酶是对一大类具有降解、修饰和生成糖苷键功能的酶的统称[12]，研究发现碳水化合物酶可促进大米麸皮中酚类物质的释放[13]，提高碎玉米粒中蛋白的提取率[14]。Du等[15]研究发现马铃薯渣经果胶酶和植物乳杆菌协同发酵后，可缩短其干燥时间，提高其防腐性。

脱脂薏米是薏米提油后的副产物，仍含有大量的蛋白质、酚类等物质，目前主要作为饲料使用或直接抛弃，此在一定程度上限制了加工企业的效益提升[3]。本研究以脱脂薏米为原料，在干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)发酵过程中分别添加木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶和葡聚糖酶，考察了碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液pH、TTA、游离氨基酸、多肽、多酚、抗氧化活性及酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响，以期阐明碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液品质的影响，为薏米加工副产物的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

干酪乳杆菌(1011CFU/g)；木聚糖酶(600U/mg)、纤维素酶(400 U/mg)、果胶酶(500 U/mg)、葡聚糖酶(50 U/mg)；乙腈：色谱纯；6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(Trolox)、2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)等均为分析纯。

脱脂薏米：本实验室自制。新鲜薏米购自贵州鑫龙食品开发有限公司，去杂粉碎过60目筛，正己烷脱脂(1∶8)，40 ℃烘干24 h，粉碎过80目筛，4 ℃贮藏备用。

1.1.2 实验仪器

HH-4恒温水浴锅，ZQLY-180V立式全温振荡培养箱，5810R冷冻离心机，SCIENTZ-18N普通型冷冻干燥机，TU-1810紫外可见分光光度计，Agilent 1100氨基酸自动分析仪，LC-20AT高效液相色谱仪。

1.2 方法

1.2.1 发酵脱脂薏米及其水提液的制备

取30 g脱脂薏米置于100 mL烧杯，然后分别加入20 mL去离子水、0.6 g干酪乳杆菌和2 000 U糖化酶(木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、葡聚糖酶)，搅拌均匀。于37 ℃恒温密闭发酵48 h，之后将样品冷冻干燥，粉碎过80目筛，4 ℃贮藏备用。单独发酵时只接种干酪乳杆菌而不添加任何糖化酶。

准确称取3 g发酵脱脂薏米，按料液比1∶10加入去离子水，25 ℃恒温振荡提取2 h，3 500 g离心10 min，收集上清液，此即为脱脂薏米水提取液。

1.2.2 pH和TTA测定

采用pH计测定水提取液的pH值；采用酸碱滴定法测定水提取液的TTA，结果表示为mg/mL(以乳酸计)[16]。

1.2.3 游离氨基酸组成测定

参考GB/T 5009.124—2016的方法略作修改，取适当体积的水提取液与10%三氯乙酸等体积混合，10 000 g离心15 min，取上清液过0.45 μm的微孔滤膜后上氨基酸自动分析仪进行游离氨基酸组成测定。

1.2.4 多肽分子质量分布测定

参照Zhao等[17]的方法略有修改，选用分离柱为TSK gel G2000 SWXL凝胶柱(300 mm×7.8 mm)，流动相为10%乙腈(含0.1%三氟乙酸)检测器波长为220 nm。取适当体积的水提取液与流动相等体积混合，10 000 g离心15 min，取上清液过0.45 μm的微孔滤膜后上机进行多肽分子质量分布测定。

1.2.5 总酚含量测定

采用福林酚法测定总酚含量[18]，取0.2 mL水提取液到10 mL离心管中，然后分别加入1.3 mL去离子水和0.25 mL福林酚试剂，摇匀。静置6 min后再分别加入0.75 mL 20% Na2CO3溶液和2.5 mL 去离子水，充分混匀。40 ℃水浴避光放置2 h后于760 nm处测定吸光值。以没食子酸绘制标准曲线，总酚含量以μg GAE/mL表示。

1.2.6 抗氧化活性测定1.2.6.1 铁离子还原能力(FRAP)

参照Benzie等[19]的方法略有修改，分别吸取180 μL水提取液、540 μL去离子水和5.4 mL新鲜配制的FRAP试剂于10 mL离心管中，振荡混匀，室温避光反应30 min后于593 nm处测定吸光值。以Trolox绘制标准曲线，FRAP以μg TE/mL表示。

1.2.6.2 ABTS+·清除能力

参照Erel等[20]的方法略有修改，分别吸取0.2 mL水提取液和3.9 mL新鲜配制的ABTS工作液于10 mL离心管中，振荡混匀，室温避光反应15 min后于734 nm处测定吸光值。以Trolox绘制标准曲线，ABTS+·清除能力以μg TE/mL表示。

1.2.7 酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性测定

参照Xu等[21]的方法进行水提取液的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性测定，以去离子水作为空白对照，绘制反应开始3 min内的酶促反应进程曲线。按照公式计算抑制率：

式中：S0和S1分别为空白对照组和样品组的进程曲线斜率。

1.3 数据统计与分析

所有实验均平行测定3次，采用SPSS 20.0软件对数据进行oneway ANOVA分析(P<0.05表示差异显著)，用Origin 2018软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液pH和TTA的影响

不同碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液的pH和TTA的影响如图1所示。脱脂薏米经干酪乳杆菌发酵后其水提取液pH显著降低(P<0.05)，而TTA则显著升高(P<0.05)。这主要是由于干酪乳杆菌在发酵过程中可通过糖酵解途径快速分解碳水化合物产生多种有机酸[22]。相较于单独发酵，不同碳水化合物酶协同发酵对水提取液的pH和TTA均无显著性影响(P>0.05)。Du等[15]报道在植物乳杆菌发酵马铃薯渣时添加果胶酶可以使体系pH下降而TTA升高。导致这种差异性可能是由于脱脂薏米单独发酵时已可为干酪乳杆菌的生长提供充足碳源，碳水化合物酶酶解提供的碳源并不能进一步促进干酪乳杆菌的代谢产酸。

注：同一指标不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。图1 碳水化合物酶协同发酵后脱脂薏米水提取液pH和TTA的变化

2.2 碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液游离氨基酸组成的影响

表1为不同碳水化合物酶协同发酵后脱脂薏米水提取液游离氨基酸组成的比较。发酵前、后及添加碳水化合物酶后水提取液的游离氨基酸组成均发生显著变化(P<0.05)。单独发酵后水提取液总氨基酸浓度相比未发酵前提高了233.56%(P<0.05)。添加碳水化合物酶后，水提取液总氨基酸浓度进一步提高(P<0.05)，其中添加葡聚糖酶组变化最为明显(P<0.05)，较单独发酵提高了32.42%。此外，添加葡聚糖酶组水提取液中必须氨基酸和非必需氨基酸浓度也显著高于其他碳水化合物酶组(P<0.05)，分别较单独发酵提高了35.60%和30.71%。相较单独发酵，碳水化合物酶协同发酵后各游离氨基酸浓度也均显著增加(P<0.05)，其中葡聚糖酶组的丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸和组氨酸浓度分别提高了71.48%、55.97%、47.79%、41.88%。碳水化合物酶的加入可促进干酪乳杆菌代谢过程中产生更多的蛋白酶，同时还可以促进发酵过程中薏米蛋白质的溶出，使蛋白酶更易作用于薏米蛋白质，因而可产生更多的游离氨基酸[14]。

表1 碳水化合物酶协同发酵后脱脂薏米水提取液游离氨基酸的变化/μg/mL

2.3 碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液多肽分子质量分布的影响

多肽类物质因具有多种生物活性，已被广泛应用于医疗、食品和化妆品等领域，研究表明多肽分子质量分布对其生物活性的发挥起着重要作用[23]。表2为不同碳水化合物酶协同发酵后脱脂薏米水提取液多肽分子质量分布的比较。未发酵薏米水提取液中88.36%的多肽属于分子质量小于5 000 u的小分子多肽，单独发酵后其面积和比例均显著提高(P<0.05)，而分子质量大于5 000 u的大分子多肽所占比例为11.65%，其在单独发酵后面积和比例均显著降低(P<0.05)。相较于单独发酵，碳水化合物酶协同发酵后水提取液多肽分子质量分布发生明显变化，果胶酶协同发酵后分子质量小于500 u的多肽比例显著提高(P<0.05)，而纤维素酶和葡聚糖酶发酵后分子质量在15 000～10 000 u的多肽比例显著提高(P<0.05)。此外，绝大多数多肽分子质量分布区间的面积均显著增加(P<0.05)，其中葡聚糖酶组显著高于其他碳水化合物酶组(P<0.05)。协同发酵后各多肽分子质量分布区间显著增加的面积表明碳水化合物酶的加入促进了薏米蛋白质的降解，这与游离氨基酸变化的趋势是一致的。

表2 碳水化合物酶协同发酵后脱脂薏米水提取液多肽分子质量分布的变化

2.4 碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液多酚含量的影响

酚类物质广泛存在于多种植物体中，是植物体的一种重要次生代谢产物，因其独特的生理功效和药用价值已广泛应用于食品、药品和化妆品行业中[24]。研究表明，脱脂薏米中含有多种酚类物质，具有较高的抗氧化活性和抗癌细胞增殖作用[3, 25]。不同碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液的多酚含量的影响如图2所示。单独发酵后水提取液多酚含量提高了27.52%(P<0.05)。碳水化合物酶协同发酵后水提取液总酚含量达到88.75～102.91 μg GAE/mL，较单独发酵组显著增加(P<0.05)，其中葡聚糖酶组增加比例最高，达到了25.27%，而木聚糖酶组增加比例最低，仅为8.03%。Qi等[9]研究发现纤维素酶协同处理可提高发酵燕麦可溶性多酚的含量，与本研究结论一致。酚类物质以结合态和游离态的形式存在于植物体内，不溶性结合酚可以多种共价键结合与植物细胞壁上的蛋白质、纤维素等大分子物质，碳水化合物酶协同发酵可在一定程度上促进这些大分子物质的降解，从而释放与之结合的酚类物质[26]。

图2 碳水化合物酶协同发酵后脱脂薏米水提取液多酚含量的变化

2.5 碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液抗氧化活性的影响

目前评价抗氧化活性的方法有很多，因不同评价方法的机制和特性不同，所得结论会有所差异[27]。本研究采用FRAP法和ABTS法对脱脂薏米水提取的抗氧化活性进行测定，不同碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液抗氧化活性的影响如图3所示。未发酵薏米水提取液的FRAP和ABTS+·清除能力分别为45.38和44.88 μg TE/mL，单独发酵后水提取液的FRAP和ABTS+·清除能力较未发酵前分别增加了37.33%和29.61%。碳水化合物酶协同发酵后水提取液的FRAP和ABTS+·清除能力分别达到66.56～86.97、62.02～75.88 μg TE/mL，相较单独发酵组显著增加(P<0.05)，其中葡聚糖酶组增加比例最高，分别达到了39.55%和30.44%，而果胶酶组增加比例最低，仅分别为7.01%和6.62%。脱脂薏米在协同发酵后水提取液中多酚和多肽类物质增加，这些物质都具有鳌合金属离子、淬灭单线态氧和清除自由基等功能，因而水提取液的抗氧化活性增加。

图3 碳水化合物酶协同发酵后脱脂薏米水提取液抗氧化活性的变化

2.6 碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响

酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶，普遍存在于生物体中，其过量表达可引发人体色素沉着性疾病，而黄嘌呤氧化酶是人体内催化次黄嘌呤和黄嘌呤产生尿酸的关键酶，尿酸的大量生成可引发痛风、糖尿病、高尿酸血症等疾病[28]。研究表明，部分来源于植物体内的多酚、多肽类物质具有较强的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性，可作为天然的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制剂使用[18, 29]。图4为不同碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响。未发酵薏米水提取的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性分别为23.56%和13.82%，单独发酵后水提取液的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性显著增强(P<0.05)，分别达到了48.03%和32.56%。碳水化合物酶协同发酵后水提取液的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性分别达到54.34%～59.87% 和40.12%～49.12%，相较单独发酵组显著增强(P<0.05)，其中葡聚糖酶组的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性显著高于其他碳水化合物酶组(P<0.05)。协同发酵后水提取液显著增加的多肽和酚类物质可能促进了其酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性的提高。与此相似，Wang等[30]报道双歧杆菌发酵提高了草药提取物的酪氨酸酶抑制活性。

图4 碳水化合物酶协同发酵后脱脂薏米水提取液酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性的变化

3 结论

研究碳水化合物酶协同发酵对脱脂薏米水提取液营养品质的影响。与单独发酵相比，协同发酵后脱脂薏米水提取液的pH和TTA未发生显著变化(P>0.05)，但其游离氨基酸和多肽的含量显著提高(P<0.05)。同时，碳水化合物酶协同发酵显著提高了水提取液的多酚含量(P<0.05)，增强了水提取液的抗氧化活性(P<0.05)。此外，相较于单独发酵，协同发酵后水提取液具有更高的酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶抑制活性(P<0.05)。葡聚糖酶相较于其他碳水化合物酶具有更好的协同增效作用。