黄晓宁，刘晶晶，韩北忠，陈晶瑜,*

（1.食品质量与安全北京实验室，中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.北京电子科技职业学院，北京 100176）

中国酿酒行业已有数千年的历史，白酒属于我国特有酒品，其年消耗量位于世界蒸馏酒第一[1]，其中浓香型、酱香型和清香型白酒是三大主要香型白酒，多年来持续主导市场地位[2]。白酒多以大曲作为糖化发酵剂进行开放式固态发酵，大曲为白酒酿造提供了必须的微生物及酶资源，造就了白酒独特的风味和品质[3-4]。提高白酒发酵过程稳定性和提升白酒质量是目前整个白酒行业发展的共同目标和技术难题[1]。

通过强化添加特定内源性微生物以提升产品品质是目前发酵食品提高产品质量的主要途径[5]，在干酪和葡萄酒的研究中均有证实[6-8]，同时也被尝试应用于白酒酿造中。例如：在大曲生产中强化加入酿酒酵母可以有效提高大曲中己酸乙酯等酯类物质含量[9]；在浓香型白酒生产中强化加入芽孢杆菌能显著提高酒醅中芳香族化合物含量等[10]。此外，通过采用内源性菌株进行大曲合成群落重构，从而管理发酵过程，是未来白酒质量控制与工业化发展的目标[11-12]。

芽孢杆菌是不同香型大曲中共有的优势细菌之一，以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）最为常见[13-16]。芽孢杆菌具有强大的水解酶系统尤其是以产淀粉酶能力突出[17]。白酒酿造中以高粱作为原料，其中含有丰富的淀粉和蛋白质类物质，淀粉降解后的小分子糖酸类物质及蛋白质降解后的氨基酸类物质，为白酒中特征风味化合物的合成提供了前体物质[18]。

本研究选用前期分别由浓香型、酱香型和清香型大曲中分离得到的105 株芽孢杆菌进行淀粉酶和蛋白酶活力测定，筛选特性优良菌株用于白酒强化发酵，验证其对挥发性代谢物质的贡献。通过筛选得到内源性特定功能芽孢杆菌，为白酒强化发酵及大曲发酵剂体外重建提供理论基础和菌株资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验室前期研究中，从山西某酒厂、北京某酒厂和四川某酒厂的浓香型、酱香型和清香型大曲中分离鉴定得到105 株芽孢杆菌，包括B. amyloliquefaciens、B. licheniformis、B. megaterium、B. pumilus、B. subtilis和B. tequilensis，菌株信息如表1所示。

表1 芽孢杆菌菌株Table 1 Bacillus strains tested in this study

Bacillus的活化和扩大培养选用营养琼脂培养基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸粉3.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、琼脂14.0 g/L；酶活性测定液体发酵培养基：可溶性淀粉10.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、葡萄糖1 g/L、NaCl 5.0 g/L、MgSO40.1 g/L、KH2PO40.5 g/L、CaCl20.05 g/L。

营养琼脂培养基 北京奥博星生物技术有限公司；可溶性淀粉、酪蛋白、3,5-二硝基水杨酸、三氯乙酸、福林-酚 北京索莱宝科技有限公司；4-甲基-2-戊醇美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

3K15冷冻离心机 德国Sigma公司；Synergy多功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；57330-U型固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）手动进样手柄、PDMS/CAR/DVB固相微萃取头 美国Supelco公司；6890-5975B气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢杆菌培养

对105 株芽孢杆菌进行活化，划线至营养琼脂培养基中，30 ℃过夜培养后。挑取单菌落接种于营养肉汤中，180 r/min，30 ℃培养16 h，调整OD600nm为1.0±0.1。吸取1 mL接种于酶活测定液体发酵培养基中，于30 ℃，180 r/min培养4 d。发酵结束后以10 000×g离心10 min取上清液，稀释适当倍数进行酶活力测定。

1.3.2 淀粉酶和蛋白酶活力测定及蛋白电泳分析

淀粉酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸法[19]，蛋白酶活力测定采用福林-酚法[20]。粗酶液十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和蛋白酶谱参照Liu Jingjing等[21]的方法，采用分离胶10.5%，浓缩胶4.5%，考马斯亮蓝R-250染色显示蛋白条带，蛋白酶酶谱在电泳分离胶中加入0.1%的明胶作为底物蛋白。

1.3.3 芽孢菌强化发酵

采用清香型白酒生产工艺流程进行实验室模拟发酵。将90 ℃的热水加入到粉碎后的高粱中，加水量为高粱投料量的65%，总润糁时间为20～22 h。后将高粱蒸煮60 min。之后加入投料量35%的冷水，冷却到室温后，加入投料量10%的大曲充分搅拌均匀，在1 L的蓝盖瓶中装入500 g酒醅，设为对照组（CK）。除大曲外，分别以1%的比率接种所筛选的芽孢杆菌菌液（～1×107CFU/mL）作为强化发酵组（B.L-1和B.S-1），依据清香型白酒发酵过程中的温度变化调整培养箱的温度进行发酵[22]，所有实验设置3 个平行，发酵周期为28 d。发酵结束后，将瓶中的酒醅混匀，取50 g酒醅样品进行后续分析。

1.3.4 理化指标检测

参考Wang Haiyan等[23]方法检测理化指标。精确称取样品10.00 g，加入蒸馏水90 mL，高速匀浆后，用pH计测定悬浮液的pH值；采用105 ℃常压恒重法测定水分含量；采用滴定法测定酸度。

1.3.5 风味代谢物组分析

挥发性风味物质测定采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatgraphy-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用。样品前处理后[24]，加入2 μL 4-甲基-2-戊醇（125 mg/L）作为内标，50 ℃萃取45 min后立即插入GC进样口，250 ℃热解吸5 min。GC-MS柱温箱升温程序为：50 ℃保持2 min，后以2 ℃/min的速率升温至85 ℃保持0.1 min，再以5 ℃/min的速率升温至230 ℃保持2 min。离子源温度为230 ℃，电离方式为电子电离，离子能量为70 eV，四极杆温度为150 ℃，质量扫描范围为20～350 u。

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0t检验进行显著性差异分析；多元统计分析使用SIMCA软件（V14.1），包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、层次聚类分析（hierarchical clustering alg，HCA）观测值间的距离以Ward法计算；基于偏最小二乘法-判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）计算得到自变量重要性指标（variable importance in projection，VIP）。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌酶活性评价

2.1.1 淀粉酶和蛋白酶活性测定

如图1所示，清香型大曲来源的芽孢杆菌酶活力普遍较高，其中枯草芽孢杆菌B.S-1与地衣芽孢杆菌B.L-1具有最高产淀粉酶和蛋白酶能力，其淀粉酶活力分别为（92.6±1.6）、（71.1±2.4 ）U/mL，蛋白酶活力分别为（66.4±3.6）、（56.6±2.4） U/mL。而浓香型和酱香型来源的芽孢杆菌酶活力普遍低于清香型大曲，此结果与Liu Jingjing等[21]研究结果一致，清香型大曲的淀粉酶活力普遍高于浓香型和酱香型大曲。

图1 芽孢杆菌蛋白酶和淀粉酶活力散点图Fig.1 Scattering plots of protease activity and amylase activity of Bacillus

2.1.2 芽孢杆菌发酵液SDS-PAGE及蛋白酶谱分析

以淀粉酶活力为13 U/mL作为临界值，选择酶活力相对较高的14 株芽孢杆菌粗酶液中的蛋白质分布情况（图2），通过SDS-PAGE分析，可见芽孢菌内蛋白质分子质量分布较广，同时存在同种菌株内蛋白差异性。其中B.S-1发酵液中蛋白酶种类最丰富（图3a）。由于B.L-1和B.S-1的淀粉酶和蛋白酶活力最高，蛋白酶谱中显示的蛋白酶种类丰富，因此选用这2 株菌进行强化发酵。

图2 芽孢杆菌发酵液SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of extracts of fermentation broths of 14 selected Bacillus with high enzyme activities

图3 芽孢杆菌发酵液蛋白酶酶谱Fig.3 Zymogram analysis of proteases in fermentation broths of Bacillus with high enzyme activities

2.2 芽孢杆菌强化发酵

2.2.1 理化指标分析

酒醅理化指标的测定，是衡量白酒发酵的重要参数[23]。发酵结束后，分别测定酒醅中的水分含量、酸度及pH值（图4A）。模拟发酵中理化指标pH值、总酸度和水分含量总体与工厂大生产结果相似[12,24]。强化B.S-1组水分含量高于对照组，强化B.L-1组总酸度高于对照组，可能由于强化B.L-1后，增加了有机酸含量，或是减弱了酒醅微生物对酸性物质的降解作用，但3 组之间pH值并无显著性差异。故强化发酵后，酒醅基本理化指标并未出现很大差异，发酵稳定进行。

图4 强化发酵后理化指标和挥发性物质含量Fig.4 Physicochemical characteristics and concentrations of volatile compounds in fermented grains produced by enhanced fermentation

2.2.2 挥发性代谢物分析

发酵酒醅中共检测得到38 种挥发性物质，包括酯类、酸类、醇类、醛酮类、酚类和杂环类。其中强化B.L-1组中的中的酯类、酸类、醇类和其他类物质的总含量明显高于对照组，而强化B.S-1组中酯类，酸类和醇类与对照组无显著性差异，醛酮酚类物质含量显著提高（图4B）。通过对比不同类别代谢物分组中的各物质的相对丰度（图5），可以看出，B.L-1和B.S-1强化发酵后乙酸乙酯的相对含量均有所提高，这与He Guiqiang等[10]的结果一致，在浓香型白酒发酵中使用强化大曲（添加B. velezensis和B. subtilis）发酵后显著提高了白酒中酯类物质含量。在强化B.L-1后，乙醇相对丰度降低，而苯乙醇占比增加，有助提高白酒中花香及蜂蜜香味[25]。强化B.L-1后酒醅中酸性物质占比基本与对照组一致，而强化B.S-1后辛酸和己酸相对含量增加。此外，4-乙基-2-甲氧基苯酚在2 组强化组中占比均有所提高，苯酚，苯乙醛相对含量均降低。添加内源性芽孢杆菌进行强化发酵，理论上改变了微生物群落中不同微生物相对丰度，故而影响到微生物代谢及微生物间相互作用，最终使得发酵代谢产物有所差异，增加了挥发性风味物质含量。

图5 强化发酵后挥发性代谢物相对含量Fig.5 Relative abundance of volatile compounds in fermented grains produced by enhanced fermentation

2.3 挥发性风味物质差异代谢组分析

2.3.1 总体代谢物层级聚类和PCA

基于强化发酵后风味物质的构成，采用HCA对不同实验组进行聚类（图6A），B.L-1组较B.S-1组和对照组距离更远，说明代谢物变化较大。通过PCA模型从整体上反映添加不同芽孢杆菌强化后的发酵酒醅中的代谢差异，累计模型拟合度良好。B.L-1组与对照组在PC1方向上差异显著，而B.S-1组和对照组在PC2方向上差异较显著（图6B），通过图6C看出，乙酸乙酯、辛酸乙酯、2-甲基丁酸酯、己酸乙酯苯乙醛等物质贡献了PC1方向的得分，而乳酸乙酯、苯乙烯、4-乙基-2-甲氧基苯酚、辛酸、4-乙基苯酚、1-己醇等物质贡献了PC2方向的得分（图6C）。

图6 基于挥发性代谢物的HCA和PCA图Fig.6 PCA and HCA plots for volatile compounds

2.3.2 差异代谢产物分析

采用同时满足基于PLS-DA模型的变量投影重要度VIP＞1、变量差异倍数（fold change，FC）＞1.5或FC＜0.5和t检验P≤0.05确定强化组分别与对照组的差异代谢产物[26]，结果如表2所示，在强化B.L-1和B.S-1组分别有21 个和11 个差异代谢物。其中4-乙基-2-甲氧基苯酚，辛酸乙酯，3-甲基丁酸乙酯，四甲基吡嗪在2 组强化中均显著性增高。4-乙基-2-甲氧基苯酚又称4-乙基愈创木酚是白酒中的特征香气物质之一，其来源主要是通过微生物降解与木质素相关的酚酸类物质形成[27]。四甲基吡嗪不仅是白酒酿造中的特征香气物质，也是白酒中的健康因子，由于其抗氧化活性使得它在心血管疾病防治方面有重要意义[28]。在Wang Peng等[29]的研究中，强化添加地衣芽孢杆菌也可以显著提高大曲中四甲基吡嗪的含量。芽孢杆菌中的碱性脂肪酶是辛酸乙酯合成的一种有效催化剂[30]，故可能提高了辛酸乙酯的含量；同时芽孢杆菌作为外来菌株加入整个发酵体系，会影响发酵过程中微生物间相互作用，从而使得多种挥发性物质含量有所改变[31]。此外，2,3-丁二醇和苯乙醇在B.L-1组中显著升高，而苯乙烯和乳酸乙酯在B.S-1组强化发酵后显著升高。强化添加B.L-1和B.S-1后，特征风味物质有所不同，故对于白酒风味的提升后续可尝试多种微生物复配添加的方式。

表2 强化发酵后的差异代谢物Table 2 Differential metabolites in fermented grains between enhanced fermentation and control

3 结 论

通过对浓香，酱香和清香型大曲中分离得到的芽孢杆菌淀粉酶和蛋白酶特性的分析，筛选出地衣芽孢杆菌B.L-1和枯草芽孢杆菌B.S-1，模拟清香型白酒发酵工艺进行强化发酵。发酵结束后强化B.L-1组酒醅中多种挥发性物质含量显著高于对照组，而强化B.S-1组中主要是醛酮酚类物质含量有所提高。其中4-乙基-2-甲氧基苯酚、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、四甲基吡嗪在2 组强化中均为差异代谢物，含量显著升高。通过强化不同芽孢杆菌进行模拟发酵可以显著提高酒醅中挥发性物质含量，菌株B.L-1和B.S-1均具有作为功能微生物进行大规模强化发酵的潜力，也可用于大曲人工合成群落中淀粉及蛋白质降解功能菌及健康因子产生菌进行进一步的研究。同时，基于酶学特性分析进行产酶优良菌株的筛选是一种高效的功能菌株筛选途径，可广泛用于白酒及其他传统谷物类发酵食品中。