王 炜，陈 磊，陈明心，张 岱，蒋 露，任伟宏

结核分枝杆菌引起的感染性疾病是造成人类死亡的十大病因之一。2018年全球有1 000万人感染结核分枝杆菌。由于抗生素在临床中的长期、大量使用，耐药结核菌感染病例逐年增多，使得结核分枝杆菌的感染防治工作面临前所未有的严峻挑战，因此，开发新型抗结核药物迫在眉睫。然而，结核病的药物开发已经停滞了数十年[1]。氨酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase，aaRS)是一个大而多样的家族，对细胞生存起着重要作用。抑制这个酶家族成员的活性可导致蛋白质合成终止，达到抗菌和抗寄生虫的目的[2]，抑制tRNA氨酰化是一种有效的抗菌策略[3]。aaRS抑制剂的研究近年来备受关注,采用不同的方法、策略，一系列aaRS抑制剂被合成出来[4]。针对不同种类的aaRS[5-9]，aaRS抑制剂表现出较好的选择性[10]，对哺乳动物的低毒性[11-13]，与aaRS亲和力高，能够强烈抑制蛋白质合成[14]。近几年发现的一种亮氨酰tRNA合成酶抑制剂在动物实验中显示出强于异烟肼的抑制结核分枝杆菌能力[15]。aaRS作为结核分枝杆菌抑制剂的作用靶标具有显著的优势。在这里，我们介绍一种大量制备重组结核分枝杆菌精氨酰tRNA合成酶(MycobacteriumtuberculosisArginyl tRNA synthetase，MtArgRS)的方法。通过构建原核表达载体，在大肠杆菌中获得了重组MtArgRS蛋白，通过生化试验验证了重组MtArgRS的蛋白折叠及其与天然底物的结合能力。通过筛选优化获得MtArgRS蛋白晶体。

1 材料与方法

1.1材料 pQE60质粒、M15大肠杆菌由河南中医药大学第一附属医院检验科保存。高保真DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、DNA marker购自Takara公司。质粒提取、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。引物及基因合成、测序在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。青霉素、链霉素、IPTG购自索莱宝公司。Milipure超滤管、PEG3350、氯化钠、氯化镁等购自默克公司。HisPur Ni-NTA树脂、蛋白质Marker购自Thermo Scientific。ATP、精氨酸、Sypro Orange购自Merck公司。结晶筛选试剂盒购自Hampton Research公司。

1.2方 法

1.2.1重组MtArgRS表达质粒的构建 根据GenBank登录号NC_000962.3核酸序列，由睿博兴科公司合成结核分枝杆菌ArgRS(MtArgRS)基因。使用PCR在MtArgRS基因两端引入NcoI、BglII限制性核酸内切酶识别序列。琼脂糖凝胶纯化PCR产物，并使用NcoI、BglII限制性核酸内切酶消化PCR产物及pQE60质粒。消化产物经琼脂糖凝胶再次纯化后，MtArgRS基因与pQE60质粒以摩尔比5∶1混合后T4连接酶25 ℃连接2 h。连接产物转化DH5α大肠杆菌，37 ℃过夜培养。使用菌落PCR鉴定阳性克隆后送公司测序，确认插入基因开放读码框是否正确。

1.2.2重组MtArgRS的制备 pQE60-MtArgRS重组质粒转化M15大肠杆菌，构成重组菌pQE60-MtArgRS/M15。挑取单菌落接种到50 mL LB培养基中37 ℃过夜培养。第2 d将培养物接种到2 L LB培养基中扩大培养。在菌液浓度达到OD600=0.8时加入1 mmol/L IPTG，18 ℃过夜诱导表达。诱导后的菌液离心收集菌泥，菌泥重悬于含有500 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L PMSF的裂解缓冲液中。超声裂解后菌液经15 000 g离心45 min去除未破碎的细菌及不溶性颗粒，可溶性部分用Ni-NTA树脂结合。首先用60 mL含有100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L PMSF缓冲液洗涤树脂，然后用20 mL含20 mmol/L咪唑的相同缓冲液洗涤。随后使用20 mL含300 mmol/L咪唑的缓冲液将结合树脂的蛋白洗脱。使用截留分子量为30 kDa的Milipure超滤管把洗脱液浓缩到1.5 mL。浓缩液注入kta层析仪中，使用100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0、1 mmol/L DTT缓冲液进行色谱分离。使用SDS-PAGE蛋白电泳分析纯化蛋白纯度和蛋白分子量。使用截留分子量为30 kDa的Milipure超滤管浓缩重组MtArgRS。Nanodrop测量蛋白质浓度并调整蛋白浓度为10 mg/mL。50 μL分装后液氮速冻，-80 ℃保存。

1.2.3重组蛋白圆二色谱分析 使用截留分子量为30 kDa的Milipure超滤管置换重组MtArgRS的缓冲液为pH8.0 PBS。在200 μL 10 mg/mL蛋白中加入15 mL pH8.0 PBS，混匀后超速离心浓缩蛋白到1 mL，再加入15 mL PBS，混匀后继续离心浓缩，如此反复4次。重新使用nanodrop调整重组蛋白浓度为10 μmol/L。交替使用无水乙醇和去离子水清洗圆二色谱石英杯后加入重组蛋白。圆二色谱光谱数据在25 ℃下使用1 nm带宽，197 nm至270 nm的1 nm步进分辨率获得。

1.2.4MtArgRS与配体的结合分析 使用100 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris pH8.0缓冲液稀释Sypro Orange到10×。将重组MtArgRS蛋白稀释到20 nmol/L浓度，与含5 mmol/L ATP、精氨酸的混合液按照1∶1体积比混合，在冰上孵育15 min，然后与10× Sypro Orange按照1∶1体积比混合后冰上孵育15 min。Bio-Rad CFX实时定量PCR仪加热程序设置如下：加热温度范围20～80 ℃。从20 ℃起始，温度每升高0.5 ℃，维持1 min后进行荧光信号检测。使用Cal Gold540通道检测Sypro Orange荧光信号。

1.2.5无配体MtArgRS结晶条件筛选 采用坐滴气相扩散法对纯化的MtArgRS进行晶体筛选，在20 ℃恒温条件下培养。选择Hampton Research公司的PEG/Ion、PEG/Ion2、Crystal Screen1、Crystal Screen2试剂盒，筛选初始结晶条件。调整重组MtArgRS蛋白浓度为10 mg/mL。在结晶孔腔内加50 μL结晶试剂，将蛋白质样品与结晶试剂按1∶1比例混合于左侧小孔，并将孔腔密封，置于恒温柜中抚育晶体生长，显微镜下定期观察晶体生长状况。获得初筛晶体后，对原始结晶条件进行微调，使用悬滴气相扩散法进行更细致的结晶优化，提高晶体质量，以获得可以用于X射线衍射的晶体。

2 结 果

2.1重组基因载体的构建 按照pQE60载体的多克隆位点设计MtArgRS基因引物扩增MtArgRS基因。扩增结果如图1，在1 500～2 000 bp DNA marker旁有一条亮带，与MtArgRS基因大小近似。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化、限制性核酸内切酶消化后连接入pQE60载体中。重组质粒经测序验证读码框完全正确。

M：GeneRuler 1 kb DNA Marker；1：ArgRS基因扩增产物

2.2MtArgRS重组蛋白的制备 诱导后的pQE60-MtArgRS/M15，经超声破碎、Ni-NTA树脂结合、洗脱、浓缩后，使用kta层析仪进一步纯化。重组MtArgRS纯化结果如图2。MtArgRS的洗脱峰值是16.70 mL，洗脱峰呈对称图形，提示重组蛋白的结构均一，如图2A所示。重组蛋白洗脱液经SDS-PAGE电泳验证重组蛋白的纯度达到分析纯度，如图2B。根据标准品的分子量及洗脱体积计算获得的方程式为Y=7.900 35-0.186 09X。根据方程式计算重组MtArgRS的分子量为62 kDa，与MtArgRS的理论分子量60.83 kDa近似。使用Nanodrop的测定值除以重组蛋白的消光系数0.856，调整蛋白质的浓度为10 mg/mL，50 μL液氮冻存后-80 ℃保存。

A:重组MtArgRS和标准品的gel filtration chromatography洗脱峰，及重组MtArgRS与标准品分子量、洗脱体积的直线拟合；B:洗脱峰对应收集孔样本的SDS-PAGE分析

2.3圆二色谱评价重组蛋白 根据已解析的大肠杆菌ArgRS晶体结构可知，ArgRS分子主要由α螺旋组成，含有少量的β层叠。为了评价大肠杆菌制备的重组MtArgRS折叠质量，使用圆二色谱对重组蛋白进行了评估，结果如图3。在圆二色谱图中可以看到在210～220 nm处有两个最低吸收峰，符合α螺旋的吸收峰特性。这一结果提示重组MtArgRS分子中的主要组成结构α螺旋正确折叠。

图3 MtArgRS的圆二色谱分析

2.4重组MtArgRS与底物及类似物结合的分析 为了验证重组MtArgRS的生物活性，我们使用thermal shift assay(TSA)分析重组蛋白与天然底物的结合能力，结果如图4。MtArgRS与天然底物ATP、Arg混合后，只有在底物ATP和Arg同时存在时可以使MtArgRS的熔融曲线发生右移，MtArgRS热稳定温度升高2 ℃，底物单独存在时不能引起MtArgRS热稳定性变化，结果如图4A。对重组MtArgRS热变性熔融曲线进行求导得到的熔融温度峰值如图4B，与同为aaRS家族的结核分枝杆菌甲硫氨酰tRNA合成酶相比MtArgRS有两个峰值温度分别是41 ℃和47.5 ℃。

A:MtArgRS与天然底物结合的TSA分析；B:MtArgRS与MtMetRS的熔融温度峰值图比较

2.5无配体MtArgRS结晶的获得 利用蒸发扩散坐滴法进行晶体筛选，重组蛋白质浓度为10 mg/mL。通过坐滴法筛选了196种结晶条件，最终找到3种生长结晶条件，如图5所示。结晶条件：图5A晶体为0.02 mol/L 二水氯化钙、20%w/v PEG 3350；图5B晶体为0.01 mol/L六水氯化镁、0.1 mol/L HEPES pH7.0、15% w/v PEG 3350；图5C晶体为0.2 mol/L 氯化钠、0.1 mol/L 醋酸钠 pH4.6、30% v/v(+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol。对晶体生长条件进行优化后，最终在0.01 mol/L 六水氯化镁、0.1 mol/L HEPES pH7.6、10% w/v PEG 条件下获得菱角分明的多面体晶体，如图6所示，晶体外形较好，体积中等大小，完整度较高。

图5 MtArgRS不同条件下的晶体形状

图6 优化条件下的MtArgRS晶体形状

3 讨 论

抗感染药研究和使用在临床实践中具有巨大的吸引力，是人类健康的一个重要领域。目前已经从天然物质中或通过筛选合成的方法鉴定到了许多特异性的aaRS抑制剂[16-18]。精氨酰tRNA合成酶是aaRS家族中的一员，属于Ia亚型。目前对aaRS基因沉默的研究显示，相对于其他aaRS家族成员，ArgRS基因的沉默可以使布氏锥虫细胞快速死亡[19]。这显示ArgRS对维持基本生命活动的重要性，因此也是非常重要的药物靶标。结核分枝杆菌ArgRS与人胞质及线粒体中的ArgRS在氨基酸序列上的一致性仅有28.54%,存在着较大的差异，这也是针对结核分枝杆菌ArgRS设计高选择性抑制剂的基础。

到目前为止，对ArgRS结构与功能的研究主要局限在大肠杆菌ArgRS，其余病原体的ArgRS研究还未报道。本研究通过使用重组质粒在大肠杆菌中成功表达MtArgRS，并通过分子筛和生化试验鉴定了重组MtArgRS的完整性和生物活性。重组MtArgRS的TSA试验结果提示Arg或ATP单独与MtArgRS结合的亲和力低。这一点提示依据Arg或ATP结构设计的类似物可能达不到抑制其活性的能力。由于ArgRS蛋白可以催化Arg与ATP合成Arg-AMP及焦磷酸(PPi)。由此推断同时加入ATP和Arg后引起ArgRS热稳定性增高的因素是Arg-AMP和PPi。Arg-AMP和PPi可以增强MtArgRS热稳定性这一现象提示，与Arg-AMP及PPi结构相似的化合物是MtArgRS抑制剂筛选的参考对象。此外，TSA实验显示ArgRS与MetRS具有不同的熔融温度峰值，MtArgRS表现出两个不同熔融温度，相差6.5 ℃，这一特性推测可能和ArgRS是多结构域蛋白有关。而MtArgRS晶体的获得为MtArgRS结构分析及抑制剂筛选提供了基础。

本次研究中建立的重组MtArgRS的制备方法，为研究和筛选结核分枝杆菌抑制剂提供了基础。

利益冲突：无