刘玉海

（甘肃省陇西县畜牧技术服务中心 碧岩镇畜牧兽医站，甘肃 陇西 748107）

巴贝斯虫病（Babesiosis），旧称焦虫病，是由巴贝斯属的原虫寄生于宿主动物红细胞内引起的一类蜱传性血液寄生虫病，感染该病的动物常表现出的临床症状有高热、贫血、黄疸、血红蛋白尿，严重时引起死亡。病理剖检具有临床症状的动物，可观察到患病动物的肺部、脑部、肾脏等实质器官毛细血管中的红细胞呈线状或集落状凝集，因此该病可影响这些实质性器官的正常功能。在世界范围内，引起牛巴贝斯虫病的主要病原有牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、分歧巴贝斯虫、大巴贝斯虫、雅氏巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、隐藏巴贝斯虫和东方巴贝斯虫等8种[1]，其中在我国分离并流行的牛巴贝斯虫有5种，分别是牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种[2]。

牛巴贝斯虫病给畜牧业带来了严重危害，其中牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫分布最广，发病率和死亡率最高，危害最为严重，这两者是牛巴贝斯虫病急性爆发的主要病原，且共享同一种传播媒介—牛蜱属的蜱。同时，这两种巴贝斯虫经常使动物处于混合感染状态，患病动物表现出严重的临床症状。鉴于此病的危害，国内外一些研究学者建立了相应的检测方法，如分子生物学方法、血清学方法。

分子生物学方法包括针对不同靶基因建立的常规PCR方法、恒温扩增技术LAMP等，但该方法只适合急性感染状态的牛或在牛体内能检测到病原。对慢性感染状态或急性感染过后带虫状态的牛在体内检测不到病原或虫体的情况而言，寻找一种合适的检测方法显得尤为重要。血清学方法检测动物体内的抗体，只要感染过本病，体内有抗体产生，该方法就适合。研究表明，体内抗体的存在要很长时间，甚至长达一年，为此建立一种适合的血清学方法显得尤为重要。

为了诊断该病，已有学者建立了检测牛巴贝斯虫病的间接免疫荧光抗体试验（IFAT）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等不同的血清学方法。但在实际临床检测中，间接免疫荧光抗体试验（IFAT）敏感性低，检测结果容易受人为因素影响，所以在大规模血清样品的检测时不适用。与该方法相比，酶联免疫吸附试验（ELISA）克服了间接免疫荧光抗体试验（IFAT）的缺点，检测的特异性和敏感性较高，检测结果比较客观，且适合高通量样品的检测[3]。

除上述分子生物学方法和血清学方法之外，病原学显微镜检查也常作为一种辅助的经典检测方法，该方法常用在急性感染的牛或在康复后牛的血液涂片中检测到牛巴贝斯虫，但该方法对检测人员的专业技术要求比较高。

纵观检测牛巴贝斯虫病的几种方法，酶联免疫吸附试验（ELISA）更具优势，抗原的来源是决定该方法优越性的关键。OIE通用的检测抗原为虫体抗原，但在牛巴贝斯虫病ELISA检测中，虫体抗原为粗抗原，经常发生种间交叉反应，且该抗原的来源有限，纯化该虫体抗原需要感染除蜱牛，纯化过程复杂且纯化量少，耗费人力、物力、财力。为了克服这一难点，本研究用已建立的重组牛巴贝斯虫棒状体相关蛋白（rhoptry-associated protein，RAP-1）作为ELISA诊断抗原，该抗原是经大肠杆菌体外培养，原核表达获得，纯化过程简单，抗原纯度和浓度均较高，且易大量繁殖纯化。为此用牛巴贝斯虫重组蛋白作为诊断抗原，对陇西县3个不同牛场黄牛群中牛巴贝斯虫感染情况进行调查，对2016—2017年采集的血样用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行牛巴贝斯虫病的血清学调查，试验过程与结果如下。

1 材料与方法

1.1 材料

牛巴贝斯虫重组蛋白Bo-RAP-1抗原，惠存在兰州兽医研究所家畜寄生虫病研究室。辣根过氧化物酶标记的兔抗牛酶标二抗，采购于美国Sigma公司。其他所需试剂和耗材均是国产，购自不同的生产供应商。

188份黄牛血清均采自陇西县3个不同地区的牛场。采血时保定牛只，颈静脉采集血样，采集完成后带回实验室，放置在37℃温箱1 h，然后放置在4℃冰箱6 h，等析出淡黄色血清后，3 000 rpm离心10 min，收集上清，放置-20℃保存备用。

1.2 ELISA试验方法

1.2.1 包被抗原 纯化的牛巴贝斯虫病棒状体蛋白Bo-RAP-1作为诊断抗原，按照0.2 μg/ml剂量加到包被液中（50 mm碳酸盐缓冲液，pH9.6），轻轻混匀后用排枪加到96孔ELISA酶标板中，每孔加样100 μl，放置4℃条件下13～15 h。

1.2.2 封闭 甩掉酶标板中的包被液，将酶标板至于ELISA专用洗板机中，用含有0.05%Tween-20的PBST洗涤液洗涤3次后，在干净吸水纸上拍干板子，用含5%脱脂乳的封闭液进行封闭，用排枪每孔加200 μl，放置在37℃条件下封闭1 h。

1.2.3 加血清 取出酶标板，甩掉酶标板中的封闭液，同1.2.2的方法洗涤后，用PBST将188份血清按1∶20稀释，同时阴阳性对照血清也按1∶20稀释，每个样品平行加到酶标板的两个竖排孔中，每孔各加100 μl，轻摇混匀，在37℃条件下放置1 h。

1.2.4 加酶标二抗 取出酶标板，甩干多余液体，同1.2.2的方法洗涤3次后，用PBST将辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体（Sigma，USA）按1∶10 000倍稀释，稀释后每孔加100 μl，轻摇混匀，在37℃条件下放置1 h。

1.2.5 显色 取出酶标板，甩干多余液体，同1.2.2的方法洗涤3次后，每孔加100 μl TMB底物液显色，用遮光纸覆盖避光，在37℃条件下放置10 min。

1.2.6 终止 取出酶标板，移去遮光纸，在每个反应孔中加入100 μl 2%H2SO4溶液，用来终止反应，此时肉眼可见颜色由蓝色变为黄色。

1.2.7 读数 将加了终止液的酶标板置于专用酶标仪上，测定光吸收值（OD450nm）。

1.2.8 判定标准 样本OD450nm值≥0.4时判为阳性；OD450nm值＜0.4时判为阴性。

2 结果

在3个不同的牛场中，牛巴贝斯虫病均存在不同程度的血清学阳性状况，阳性血清的感染率为21.4%～30.2%（见表1）。

表1 2016—2017年陇西县牛巴贝斯虫病血清学检测结果

3 讨论与结论

牛巴贝斯虫病是一种对家畜危害十分严重的血液寄生虫病，每年4—10月是该病的传播媒介频繁活动时间，在这期间，牛群感染本病的风险也最高，给养牛业造成了极大的损失。

陇西县属干旱半干旱区，在牛巴贝斯虫和泰勒虫等血液原虫病的防疫上目前尚未有好的方法。这一地区由于媒介蜱的存在，每年都流行牛巴贝斯虫病，阻碍了陇西县畜牧业的发展。因此，应阻断媒介蜱的传播，制定家畜原虫病防疫计划，采取灭蜱等综合预防措施，以减少畜牧业的损失。