刘 杨 赵向绒 郭春艳 李 研 胡 军

（陕西省人民医院中心实验室，西安交通大学医学院第三附属医院，西安710068）

甲型流感病毒（influenza A virus）属正黏病毒科，流感病毒属，是引起急性呼吸道感染的主要病原体之一，抗原易变异，多次引起世界性大流行，给人类生命健康和经济发展造成极大危害。随着我国经济发展迅速，跨地区交流、合作、旅游等日益频繁，大中型城市扩建及大部分地区城镇化建设逐年增加，城镇人口居住密集，为流感传播提供了有利条件。因此，流感的快速检测、治疗、病毒变异及病毒致病机制研究具有重要意义。特异性单克隆抗体（monoclonal antibody，mAbs）在流感病毒快速检测、动物感染模型保护效果评价及病毒研究领域应用广泛［1-2］。本研究采用A/PR/8/34（H1N1）流感病毒颗粒免疫小鼠制备mAbs，并鉴定抗体特性，评价抗体在免疫荧光、细胞免疫化学染色和ELISA中的作用，为流感快速检测及研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 A/PR/8/34（H1N1）甲型流感病毒为本实验室保存毒株；MDCK细胞为陕西省疾病预防控制中心病毒所惠赠；9日龄SPF鸡胚购自北京实验动物中心；普通鸡胚购自西安华禽养殖场；6～8周龄BALB/c小鼠购自西安交通大学医学院实验动物中心；CP90WX超速离心机购于自日本日立公司；荧光显微镜购自OLYMPUS；辣根过氧化物酶（HRP）和牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma公司；胎牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所；RPMI1640和DMEM培养基购自Gibco公司；mAb亚型鉴定试剂盒、FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体购自Southern biotech公司；BCA微量蛋白定量试剂盒、FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体购自Thermo Fisher Scientific公司；TPCK-胰酶购自Sigma公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥。

1.2 方法

1.2.1 病毒鸡胚培养和纯化 取A/PR/8/34（H1N1）毒种接种于9日龄鸡胚尿囊腔，35℃培养72 h，收集尿囊液，4℃下甲醛灭活。3 000 r/min（离心半径10 cm）离心10 min，收集上清，30 000 r/min（离心半径9.21 cm）超速离心4 h，PBS（100 mmol/L，pH=7.2）重悬，铺于预先制备的5%～60%蔗糖密度梯度液，水平转头（P40ST）20 000 r/min（离心半径15.88 cm）离心6 h，收集病毒层，BCA微量蛋白定量试剂盒对纯化产物进行总蛋白浓度定量，按照试剂盒说明书进行，收集病毒层置于-80℃保存［3］。

1.2.2 mAbs制备 BALB/c小鼠腹腔注射纯化的A/PR/8/34（H1N1）病毒颗粒抗原进行免疫，0.05 mg/只，每隔2周加强免疫，融合前3 d追加免疫。无菌条件下取免疫小鼠脾脏研磨并与Sp2/0细胞混合，50%PEG4000溶液进行细胞融合，加入铺有饲养细胞的96孔板，HAT培养基选择培养，间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清，筛选阳性孔按有限稀释法进行亚克隆，建立mAb细胞株。RP⁃MI1640培养基（含10%胎牛血清）培养阳性杂交瘤细胞，杂交瘤细胞一部分冻存作为细胞种子，一部分腹腔内注射于BALB/c小鼠（腹腔内注射0.2 ml石蜡油后10 d的小鼠），0.2 ml/只（1.25×104个），10 d左右收集腹水［4］。

1.2.3 mAbs反应特性鉴定按照mAb亚型鉴定试剂盒说明书进行抗体类和亚类鉴定。采用建立的ELISA法检测抗体效价，单抗腹水依次进行倍比稀释，进行ELISA试验，Sp2/0细胞腹水作为阴性对照。mAbs特异性和交叉反应性鉴定：分别将A/PR/8/34（H1N1）、A/Shaaxi/01/2009（H1N1）抗原、A/Shaanxi/01/2014（H3N2）抗原、胎牛血清、正常鸡胚尿囊液等不同抗原包被ELISA板，分别加入mAbs，检测与抗原是否具有交叉反应性。

1.2.4 中和试验 无菌条件下收集小鼠腹水，56℃灭活30 min，4倍系列稀释mAb，分别取50µl与等体积半数组织细胞感染量（50%tissue culture infec⁃tious dose，TCID50，）病毒液混合，37℃孵育2 h，加入含有MDCK细胞的96孔板中，37℃孵育5～7 d，以MDCK细胞未出现CPE的最大抗体稀释度的蛋白浓度作为mAbs中和滴度。

1.2.5 血凝抑制（HI）试验 测定流感病毒血凝滴度，流感病毒培养液2倍系列稀释后加入“U”型孔中，取等量0.5%鸡红细胞悬液与其混合室温静置1 h，以出现红细胞完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数作为血凝滴度。2倍系列稀释mAb后加入“U”型孔中，与4个红细胞凝集单位的A/PR/8/34（H1N1）病毒混合，室温静置30 min。加入0.5%鸡红细胞悬液后充分混匀，室温静置1 h，以不出现红细胞凝集的最高稀释度为终点，其稀释度对应的抗体蛋白浓度作为HI效价。具体方法参照“WHOManual on Animal Influenza Diagnosis and Sur⁃veillance”。

1.2.6 免疫荧光试验 DMEM培养基（含10%胎牛血清）培养MDCK细胞，待细胞长至单层后移去细胞培养液，加入DMEM培养基（含0.002 mg/ml TPCK-胰酶）病毒培养液，接种流感病毒，未接种流感病毒的正常细胞作为对照，待接种病毒的细胞病变效应（CPE）达到50%～75%时，分别收集病毒感染细胞和对照组正常细胞，4%多聚甲醛室温固定1 h，PBST洗3次，加入抗mAbs，37℃孵育1 h，PBST洗6次，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育1 h，PBST洗6次，伊文氏蓝衬染5 min后，置荧光显微镜下观察。

1.2.7 细胞免疫化学染色试验 DMEM培养基（含10%胎牛血清）培养MDCK细胞，待细胞长至单层后移去细胞培养液，加入DMEM培养基（含2µg/ml TPCK-胰酶）病毒培养液，接种流感病毒，并设立未接种流感病毒的正常细胞为对照，待接种病毒的细胞病变效应（CPE）达50%～75%时，分别收集病毒感染细胞和对照组正常细胞，10%甲醛室温固定1 h，PBST洗3次，加入抗mAbs，37℃孵育1 h，PBST洗6次，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育1 h，PBST洗6次，苏木素室温染色10 min，分化、返蓝后置显微镜下观察。

1.2.8 双抗体夹心ELISA法 0.5 mol/L碳酸盐缓冲液（pH=9.6）分别稀释mAb PR8-24和PR8-25至浓度为0.005 mg/ml，0.1 ml/孔包被96孔板，4℃静置过夜，PBST洗3次，5%BSA封闭液于37℃孵育1 h，2倍系列稀释500 TCID50A/PR/8/34（H1N1）流感病毒液，0.1 ml/孔加入酶标板孔中，37℃孵育1 h，PBST洗6次，分别加入HRP标记的mAb PR8-25和PR8-24，0.1 ml/孔，37℃孵育1 h，PBST洗6次，加入TMB显色液37℃孵育10 min，加入2 mol/L H2SO4终止液，测定450 nm处吸光度（OD450）。

1.3 统计学处理 采用SPSS21.0软件进行两变量线性相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分泌抗A/PR/8流感病毒mAbs的杂交瘤细胞株建立 共获得13株抗A/PR8/34（H1N1）mAb杂交瘤细胞株，效价均＞104，mAbs反应特性见表1，PR8-15为IgG3，其他12株均为IgG1亚类。PR8-10、PR8-19、PR8-20、PR8-26、PR8-28和PR8-30单抗HI滴度均≤3µg/ml，血凝抑制活性较强。PR8-13和PR8-15无中和活性，其他11株均具有中和活性。具有中和活性的mAbs PR8-10、PR8-14、PR8-16、PR8-18、PR8-19、PR8-20、PR8-24、PR8-25、PR8-26、PR8-28和PR8-30的HI与MN滴度相关性分析结果显示，HI与MN滴度呈正相关（Pearson相关性=0.952，P＜0.01，R2=0.906，图1）。

2.2 mAbs特异性和交叉性鉴定 细胞免疫荧光试验结果显示，PR8-10、PR8-14、PR8-24、PR8-25、PR8-26、PR8-28、PR8-30 mAbs可与A/PR/8/34（H1N1）流感病毒感染的MDCK细胞结合，不与正常MDCK细胞反应（图2）。细胞免疫荧光试验分析单抗交叉反应特性显示，PR8-24可与A/Shaanxi/02/2014（H1N1）结合，不与A/Shaanxi/01/2014（H3N2）结合。PR8-25、PR8-26、PR8-28、PR8-30可与A/Shaanxi/01/2014（H3N2）反应，不与A/Shaanxi/02/2014（H1N1）反应（图3）。

2.3 mAbs在细胞免疫化学试验中的应用 采用PR8-24、PR8-25、PR8-28、PR8-30 mAbs进行细胞免疫化学染色试验，均可特异性与A/PR/8/34（H1N1）流感病毒感染的MDCK细胞结合，特异性着色主要分布于细胞浆（图4）。

表1 mAbs特性（μg/ml）Tab.1 Characteristics of mAbs（μg/ml）

图1 HI滴度与MN滴度线性相关性分析Fig.1 Linear correlation analysis between HI titer and MN titer

2.4 双抗体夹心ELISA法建立 根据抗体滴度、HI滴度、特异性、MI滴度和配对检测A/PR/8/34（H1N1）病毒灵敏性，共筛选出2株用于双抗体夹心ELISA法构建的mAbs，分别为PR8-24和PR8-25。双抗体夹心ELISA法检测结果显示，包被PR8-24和HRP标记PR8-25配对时，病毒培养液线性范围为15.6～500 TCID50，R2=0.996 5。包被PR8-25和HRP标记PR8-24配对时，病毒培养液线性范围为15.6～500 TCID50，R2=0.997 9。以PR8-24作为包被抗体和以PR8-25作为酶标抗体配对双抗体夹心ELISA的检测最低限为15.6 TCID50/0.1 ml，以PR8-25作为包被抗体和以PR8-24作为酶标抗体配对双抗体夹心ELISA的检测最低限为62.5TCID50/0.1 ml（图5）。

图2 IFA鉴定mAbs与A/PR/8/34（H1N1）流感病毒感染MDCK细胞的反应特性Fig.2 Identification of response characteristics of mAbs to MDCK cells infected with A/PR/8/34（H1N1）influenza virus by IFA

图3 IFA试验鉴定流感病毒感染MDCK细胞Fig.3 IFA test for identification of MDCK cell infection by influenza virus

图4 流感病毒感染MDCK细胞细胞免疫组化试验Fig.4 Cell-based immunohistochemistry test of MDCK cells infected with influenza virus

图5 ELISA测定A/PR/8/34/（H1N1）流感病毒培养上清的标准曲线Fig.5 Standard curve of A/PR/8/34（H1N1）influenza virus culture supernatant detection by ELISA

3 讨论

H1N1流感病毒是导致流感流行的主要甲型流感病毒，由于H1N1流感病毒抗原漂移和抗原变异频率较高，针对H1N1的流感疫苗需要不断变化以维持保护作用。甲型流感病毒有2个重要的表面糖蛋白，分别为血凝素和神经氨酸酶，其中血凝素蛋白在病毒黏附和进入宿主细胞过程中发挥重要作用，同时也是刺激机体产生中和抗体的主要病毒结构蛋白［5-6］。根据血凝素蛋白功能，其蛋白可分为3个结构域，分别为受体结合域、位于血凝素头部下面的退化酯酶结构域和邻近病毒包膜的茎部区域，茎部区域是低pH触发膜融合激活结构域。血凝素抗体可识别并结合血凝素头部或茎部，中和抗体与血凝素头部结合后可抑制病毒黏附，而抗体与血凝素茎部结合后可抑制病毒与宿主细胞膜融合，抑制血凝素HA0被蛋白酶水解为HA1/HA2。

甲型流感病毒的抗原表位，尤其是中和表位主要位于病毒血凝素和神经氨酸酶上，而血凝素和神经氨酸酶为病毒包膜上的糖蛋白。KUENSTLING等［7］利用原核表达系统表达重组低聚HA1蛋白，重组低聚HA1蛋白纯化过程中经过适当折叠可使免疫小鼠产生中和抗体，但基因工程技术表达的血凝素或神经氨酸酶蛋白可能与自然病毒的血凝素或神经氨酸酶结构不同，尤其是空间构象表位不同，血凝素糖基化修饰数量和质量及糖基化修饰位置对其抗原性及抗体交叉反应性具有重要作用，决定抗原与抗体间的亲和能力和中和活性［8］。流感病毒也可通过血凝素糖基化逃避中和抗体结合，导致免疫逃避［9］。因此，课题组以纯化的H1N1流感病毒作为免疫抗原，尽可能保证病毒抗原表位与天然结构一致，常规免疫BALB/c小鼠制备mAbs，尽可能制备及筛选出特异性抗甲型流感病毒mAbs，为后续研究提供依据。本研究共制备13株稳定分泌抗A/PR8/34（H1N1）mAbs的杂交瘤细胞株，均具有HI活性，其中6株HI滴度≤3µg/ml。PR8-13和PR8-15无中和活性，其他11株均具有中和活性，mAb HI滴度与MN滴度呈正相关，mAb HI滴度与各MN滴度变化趋势一致，mAb HI活性较高时，相应mAbs MN活性也较高，而HI试验较MN试验操作简单、实验周期短、结果判定客观，因此，血凝素抗体可用HI活性在一定条件下间接反映MN活性。此次制备的PR8-13和PR8-15 mAbs具有HI活性，无MN活性，表明具有HI活性的抗体不一定具有MN活性，而其他11株mAbs既有MN活性又具有HI活性，表明具有MN活性的血凝素抗体大多具有HI活性，主要与抗体结合的抗原表位有关，MN抗体可识别并结合血凝素头部或茎部，与血凝素头部结合后可抑制病毒黏附和血凝素介导的膜融合［10-12］。而与血凝素茎部结合后可通过阻断pH诱导的血凝素构象改变抑制病毒与宿主细胞膜融合［13］，也可抑制血凝素HA0被蛋白酶水解为HA1/HA2，血凝抑制活性的抗体主要识别并结合于血凝素头部，因此，推测PR8-13和PR8-15 mAbs可能只结合于血凝素头部。另外，MN抗体也可通过Fc段介导抗体依赖的细胞毒性效应和补体依赖的细胞毒效应［12］。

PR8-24、PR8-25、PR8-26、PR8-28和PR8-30不仅可与A/PR/8/34（H1N1）反应，也可与A/Shaanxi/01/2014（H3N2）反 应，其 中PR8-24可 与A/Shaanxi/02/2014（H1N1）反应，推测A/PR/8/1934（H1N1）血凝素蛋白与A/Shaanxi/01/2014（H3N2）或A/Shaanxi/02/2014（H1N1）具有相似抗原表位，尤其是A/Shaanxi/01/2014（H3N2）。与此同时，PR8-24、PR8-25、PR8-28和PR8-30既可用于IFA试验也可用于细胞免疫化学染色，在流感病毒感染细胞或动物模型中，可依据抗体工具进行免疫组化或IFA试验分析病毒感染水平，也可根据血凝素表位进行病毒亚型鉴定［14-15］。mAbs不仅可用于病毒感染研究，YEO等［16］利用2株配对的抗H7亚型流感病毒单抗建立了铕纳米颗粒荧光免疫层析检测H7流感病毒法，该方法比胶体金免疫层析检测敏感性高25倍，免疫层析技术的最大优点在于实现病毒快速定性检测，但不能用于定量分析，因此，本研究采用上述13株mAbs随机配对设计双抗体夹心ELISA法检测A/PR/8/34（H1N1），筛选出PR8-24与PR8-25可用于双抗体夹心ELISA检测，并以PR8-24作为包被抗体和以PR8-25作为辣根过氧化物酶标记抗体建立双抗体夹心ELISA时斜率最大，效果最好，ELISA的相对定量线性检测范围为15.6～500 TCID50，可为H1N1流感病毒快速定量方法的建立提供基础，以及用于病毒血凝素蛋白定量或疫苗抗原定量分析［17］。TCID50测定病毒滴度周期较长，一般需要5～7 d，并以观察细胞病变效应或以血凝活性判断结果，结果判断主观性强，而采用预先建立的双体抗夹心ELISA法可快速检测病毒相对含量，且结果数据为吸光度值，结果较为客观。RAJENDRA等［18］巧妙设计出可以检测HA茎部正确折叠与否的捕获ELISA法，以抗血凝素头部线性表位为包被抗体，以抗血凝素茎部空间构象表位的抗体为检测抗体，既可定量分析病毒血凝素含量，也可检测血凝素茎部保守区空间构象是否正确折叠，为流感病毒研究、疫苗含量测定、抗原表位及空间构象分析提供支持。

甲型流感病毒是目前秋冬季节呼吸道感染的主要病原体，对甲型流感病毒的致病性、病毒毒力、疫苗、抗原保护位点及治疗药物研究显得尤为重要，而此次制备的抗甲型流感病毒H1N1 mAbs为流感病毒的进一步研究提供基础，也为后续病毒快速定量检测提供技术支撑。由于本实验室甲型流感病毒各种亚型代表株不全，不能与其他亚型的甲型流感病毒进行交叉分析，需进一步详细鉴定mAbs反应特性，依据抗体特性分析其抗原表位及应用。