陈吉柏 范长玲 张 浩（海南省儋州市人民医院胸心肿瘤外科，儋州571799）

肺癌是世界第一大癌症，在恶性肿瘤中致死率最高，且患者数呈逐年上升趋势，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者占患者总数的85%左右，5年生存率低于15%［1-2］。手术和靶向治疗是肺癌个性化治疗的主要手段，研究肺癌细胞增殖和转移的分子机制是肺癌基础研究的热点。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在肿瘤中通常表达失调，参与肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌及血液系统恶性肿瘤、神经母细胞瘤等肿瘤发生、发展及耐药等过程［3］。多种lncRNA在肺癌中差异表达，参与癌细胞增殖、迁移、凋亡等多种生理过程［4］。HOXC-AS3是一种位于染色体7p13区域的lncRNA，在胃癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌等肿瘤组织中高表达，与肿瘤细胞增殖、转移、侵袭有关［5-7］。lncRNA HOXC-AS3在肺癌中表达和作用尚未明确。本研究通过starBase预测发现miR-216a-5p可能是lncRNA HOXC-AS3的靶点，miR-216a-5p在小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）中表达下调，与SCLC恶性进展和化学耐药相关［8-9］。lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p在肺癌中的关系尚未明确。本研究检测两者在肺癌组织和细胞系中的含量，假设lncRNA HOXC-AS3可靶向miR-216a-5p调控肺癌细胞增殖、侵袭和迁移，并对此进行验证，以期为肺癌治疗提供新靶点。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 选取2017年1月至2018年6月于本院病理检查确诊为NSCLC的患者手术切除的肺癌组织及癌旁组织（距离肺癌组织边缘＞1.5 cm）各45例，男性30例，女性15例，年龄23～76岁，平均年龄（51.20±16.22）岁，鳞癌28例，腺癌15例，其他2例。NSCLC分级：Ⅰ级5例，Ⅱ级12例，Ⅲ级19例，Ⅳ级20例。NSCLC诊断标准参照《非小细胞肺癌临床指南》，所有患者术前未接受放化疗治疗。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.1.2 细胞、主要试剂与仪器 人肺癌细胞系H1299、A549、GLC-12和人正常肺上皮细胞株BEAS-2B（ATCC）；胎牛血清、DMEM培养基（Gibco公司）；胰蛋白酶（Sigma-Aldrich公司）；Transwell板（美国Corning公司）；细胞增殖抗原Ki-67、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、神经型钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）抗体（美国Santa cruz公司）；引物、lncRNA HOXCAS3小干扰RNA（si-HOXC-AS3）及其阴性对照、ln⁃cRNA HOXC-AS3过表达载体（pcDNA-HOXC-AS3）及对照空载体（overexpression control）、miR-216a-5p模拟物（mimics）及阴性对照序列（miR-con）、miR-216a-5p抑制剂（anti-miR-216a-5p）及抑制剂阴性对照序列（anti-miR-con）、lncRNA HOXC-AS3野生型（WT-HOXC-AS3）和突变型（MUT-HOXC-AS3）报告载体（上海吉玛制药有限公司）；双荧光载体双荧光素酶报告系统试剂盒（美国Promega公司）；Lipo⁃fectamine 2000、RNA提取试剂Trizol、Real-time PCR试剂盒、反转录试剂盒（RT-PCR）（美国Invitrogen公司）；CCK-8试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒（上海碧云天）；Real-time PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 H1299、A549、GLC-12和BEAS-2B细胞培养于含10%FBS、1%青-链霉素的DMEM培养基，培养条件：37℃、5%CO2、湿度97%，每2～3 d更换1次培养基。当细胞生长至80%融合时，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞进行后续实验。

1.2.2 qRT-PCR检测lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p表达 Trizol试剂提取总RNA，微量核算仪检测RNA纯度和浓度，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应。反应程序为：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35个循环。引 物 序列：lncRNA HOXC-AS3 F：5′-CACCTCTCTCATCGAAAAACCG-3'，R：5'-GCACCAGGAAAGAGGACAATTC-3'；β-actin F：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，R：5'-GCTGCTACCTTCACCGTTCC-3'；miR-216a-5p F：5'-TAATCTCAGCTGGCAACT-3'，R：5'-GGTGTC⁃GTGGAGTCG-3'；U6 F：5'-TGCGGGTGCTCGCTTCG⁃GCAGCA-3'，R：5'-CCACTGCAGGGTCCGAGGT-3'。lncRNA HOXC-AS3以β-actin为内参，miR-216a-5p以U6为内参，2-ΔΔCt法计算。

1.2.3 细胞转染 将对数生长期A549细胞调整为1×104个/ml，2.5 ml/孔接种于6孔板，当生长至60%融合时，更换不含FBS的DMEM培养基。根据转染说明书将Silence control、si-HOXC-AS3、overex⁃pression control、pcDNA-HOXC-AS3、si-HOXC-AS3与anti-miR-con、si-HOXC-AS3与anti-miR-216a-5p分别转染至A549细胞中，依次记为si-con组、si-HOXC-AS3组、pcDNA组、pcDNA-HOXC-AS3组、si-HOXC-AS3+anti-miR-con组、si-HOXC-AS3+anti-miR-216a-5p组。转染6 h后更换新鲜培养基，继续培养至48 h，收集细胞用于后续实验。

1.2.4 CCK-8法测定细胞存活率 转染后的各组细胞调整为1×104个/ml，200µl/孔接种于96孔板，培养48 h后，20µl/孔 加入CCK-8溶液，继续培养2 h，酶标仪测定450 nm处吸光度（A），细胞存活率（%）=A实验组/A对照组×100%。

1.2.5 Western blot检测增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白表达 转染后的各组细胞调整为1×104个/ml，1.0 ml/孔接种于24孔板，培养48 h后，胰蛋白酶消化，收集细胞，加入RIPA细胞裂解液冰上孵育20 min，充分裂解后，4℃、12 000 r/min离心10 min，-80℃保存备用。BCA法测定上清中蛋白含量，取适量蛋白溶液，加入1×上样缓冲液，混合均匀，100℃煮沸5 min，蛋白变性后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入Ki-67（1：1 000）、Cyclin D1（1：1 000）、MMP-2（1：2 000）、MMP-9（1：2 000）、N-cadherin（1：1 000）、Vi⁃mentin（1：1 000）、E-cadherin（1：1 000）和β-actin（1：5 000）一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，5 min/次。加入辣根过氧化酶标记二抗（1：1 000），室温孵育2 h，加入ELC化学发光试剂，避光显影后凝胶成像系统曝光拍照。以β-actin为内参，Image J软件分析蛋白条带灰度值。目的蛋白的相对表达水平以其蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值的比值表示。

1.2.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭 迁移实验：转染后的各组细胞用不含血清的DMEM培养基调整浓度为2×105个/ml，Transwell小室置于24孔板，下室加入500µl含10%FBS培养基，上室加入100µl细胞悬液，培养48 h后弃培养基，取出小室，棉签擦去基质胶和上层小室细胞，4%甲醛固定30 min，0.4%结晶紫染色15 min，显微镜观察。随机选取5个视野计数。侵袭实验：将-20℃取出的Matrigel液化后用4℃无血清培养基以1：8比例稀释，取50µl加入Transwell小室上室，自然晾干，加入100µl细胞悬液，下室加入500µl含10%FBS的培养基，后续操作同迁移实验。

1.2.7 划痕实验检测细胞迁移能力 用marker笔在6孔板背后均匀划5条直线，横穿过孔，调整细胞浓度为1×104个/ml，2.5 ml/孔接种于6孔板，当细胞生长至80%融合时，弃培养基，200µl无菌枪头尖端在各孔相同位置划线，PBS冲洗3次，去除划下的细胞，每孔加入无血清培养基培养24 h，拍照，计算细胞划痕愈合率。

1.2.8 双荧光素酶报告实验 生物信息学软件预测显示lncRNA HOXC-AS3与miR-216a-5p的核苷酸序列存在连续结合位点，PCR扩增含miR-216a-5p结合位点的lncRNA HOXC-AS3序列，构建lncRNA HOXC-AS3的野生型（WT-HOXC-AS3）载体。采用基因突变技术将结合位点突变后，构建lncRNA HOXC-AS3突变型（MUT-HOXC-AS3）载体。分别将WT-HOXC-AS3、MUT-HOXC-AS3与miR-con或miR-216a-5p共转染至A549细胞，转染6 h后更换新鲜培养基，继续培养48 h，收集细胞，裂解，离心收集上清，-20℃保存或直接检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据处理和分析，所有数据以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较进行单因素方差分析，总体差异采用LSD-t检验进行两两比较。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lncRNAHOXC-AS3和miR-216a-5p在肺癌组织和A549、A549、GLC-12细胞系中的表达 与癌旁组织（45例）相比，肺癌组织组中lncRNA HOXC-AS3水平显著上升，miR-216a-5p水平显著下降（P＜0.05）；与人正常肺上皮细胞BEAS-2B组相比，肺癌细胞H1299、A549和GLC-12组中miR-216a-5p水平下降，lncRNA HOXC-AS3水平显著上升（P＜0.05，表1、2）。体外细胞实验选择水平差异较大的A549细胞进行。

2.2 沉默或过表达lncRNA HOXC-AS3对肺癌A549细胞增殖的影响 与si-con组相比，si-HOXCAS3组A549细胞lncRNA HOXC-AS3表达和细胞活性显著降低，增殖蛋白Ki-67和Cyclin D1表达显著降低（P＜0.05）；过表达lncRNA HOXC-AS3的pcD⁃NA-HOXC-AS3组则结果相反，见图1、表3。

表1 lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p在肺癌组织和癌旁组织中的表达（±s，n=45）Tab.1 Expressions of lncRNA HOXC-AS3 and miR-216a-5p in lung cancer tissues and adjacent tissues（±s，n=45）

表1 lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p在肺癌组织和癌旁组织中的表达（±s，n=45）Tab.1 Expressions of lncRNA HOXC-AS3 and miR-216a-5p in lung cancer tissues and adjacent tissues（±s，n=45）

Note：Compared with adjacent tissuesgroup，1）P＜0.05.

Groups Adjacent tissues Lung cancer tissue t P lncRNA HOXCAS3/β-actin 0.94±0.27 3.28±0.671）21.383 0.000 miR-216a-5p/U6 1.03±0.19 0.66±0.131）10.781 0.000

2.3 沉默或过表达lncRNA HOXC-AS3对肺癌A549细胞迁移的影响 与si-con组相比，si-lncRNA HOXC-AS3组MMP-2和MMP-9含量、迁移细胞数和侵袭细胞数显著下降，细胞划痕愈合率降低（P＜0.05）；过表达lncRNA HOXC-AS3的pcDNA-HOXCAS3组则结果相反（图2、表4）。

表2 lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p在正常肺上皮细胞株和肺癌细胞株中的表达（±s，n=9）Tab.2 Expressions of lncRNA HOXC-AS3 and miR-216a-5p in normal lung epithelial cell lines and lung can⁃cer cell lines（±s，n=9）

表2 lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p在正常肺上皮细胞株和肺癌细胞株中的表达（±s，n=9）Tab.2 Expressions of lncRNA HOXC-AS3 and miR-216a-5p in normal lung epithelial cell lines and lung can⁃cer cell lines（±s，n=9）

Note：Compared with the BEAS-2Bgroup，1）P＜0.05.

Groups BEAS-2B H1299 A549 GLC-12 F P lncRNA HOXCAS3/β-actin 1.02±0.23 4.15±0.591）5.25±0.421）3.81±0.641）118.155 0.000 miR-216a-5p/U6 1.04±0.12 0.42±0.081）0.36±0.111）0.55±0.091）83.671 0.000

图1 Western blot检测沉默或过表达lncRNA HOXC-AS3对肺癌A549细胞增殖蛋白Cyclin D1和Ki-67表达的影响Fig.1 Effects of silenced or overexpressed lncRNA HOXC-AS3 on expressions of proliferation proteins Cyclin D1 and Ki-67 in lung cancer A549 cells de⁃tected by Western blot

表3 沉默或过表达lncRNA HOXC-AS3对肺癌A549细胞增殖的影响（±s，n=9）Tab.3 Effectsof silenced or overexpressed lncRNAHOXCAS3 on proliferation of lung cancer A549 cells（±s，n=9）

表3 沉默或过表达lncRNA HOXC-AS3对肺癌A549细胞增殖的影响（±s，n=9）Tab.3 Effectsof silenced or overexpressed lncRNAHOXCAS3 on proliferation of lung cancer A549 cells（±s，n=9）

Note：Compared with silence control group，1）P＜0.05；compared with overexpression control group，2）P＜0.05.

Groups NC silence control si-HOXC-AS3 overexpression control pcDNA-HOXC-AS3 F P lncRNA HOXCAS3/β-actin 0.98±0.13 1.02±0.12 0.23±0.051）0.98±0.11 5.06±0.642）368.968 0.000 Cell viability（%）99.14±7.72 94.69±9.16 68.67±5.341）95.86±9.37 162.74±7.612）172.609 0.000

图2 Western blot检测沉默或过表达lncRNA HOXC-AS3对肺癌A549细胞MMP-2和MMP-9表达的影响Fig.2 Effects of silenced or overexpressed lncRNA HOXC-AS3 on expressions of proliferation pro⁃teins MMP-2 and MMP-9 in lung cancer A549 cells detected by Western blot

表4 沉默或过表达lncRNA HOXC-AS3对肺癌细胞A549迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Tab.4 Effects of silenced or overexpressed lncRNA HOXC-AS3 on migration and invasion of lung can⁃cer A549 cells（±s，n=9）

表4 沉默或过表达lncRNA HOXC-AS3对肺癌细胞A549迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Tab.4 Effects of silenced or overexpressed lncRNA HOXC-AS3 on migration and invasion of lung can⁃cer A549 cells（±s，n=9）

Note：Compared with silence control group，1）P＜0.05；compared with overexpression control group，2）P＜0.05.

Groups NC silence control si-HOXC-AS3 overexpression control pcDNA-HOXC-AS3 F P Cell migration number 183.86±10.25 174.54±14.35 103.30±7.251）181.56±13.36 264.67±18.312）167.815 0.000 Cell invasion number 78.85±7.41 84.49±9.48 47.30±7.801）82.32±9.67 147.55±7.762）166.896 0.000 Cell scratch heal⁃ing rate（%）88.34±4.42 86.35±4.64 74.87±3.131）84.35±4.34 95.64±5.672）24.614 0.000

图3 Western blot检测肺癌细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达Fig.3 Expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimen⁃tin proteins in lung cancer A549 cells detected by Western blot

2.4 沉默或过表达lncRNA HOXC-AS3对肺癌A549细胞EMT的影响 如图3所示，与si-con组相比，si-lncRNA HOXC-AS3组A549细胞N-cadherin和Vimentin蛋白含量降低，E-cadherin蛋白含量升高（P＜0.05）；过表达lncRNA HOXC-AS3的pcDNAHOXC-AS3组则结果相反。

2.5 lncRNA HOXC-AS3靶向作用于miR-216a-5p 如图4所示，starBase预测结果显示，lncRNA HOXC-AS3序列中存在与miR-216a-5p互补的核苷酸序列。双荧光素酶报告系统结果显示，与miRcon组相比，miR-216a-5p组野生型WT-HOXC-AS3的荧光素酶相对活性显著下降（P＜0.05）；而突变型MUT-HOXC-AS3的荧光素酶相对活性变化无统计学意义（表5）。qRT-PCR结果显示，沉默HOXC-AS3可上调miR-216a-5p含量，过表达HOXC-AS3可下调miR-216a-5p含量（P＜0.05，表6）。

2.6 干扰miR-216a-5p部分逆转沉默HOXC-AS3对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用 如图5、表7所示，与si-HOXC-AS3+anti-miR-con组相比，si-HOXC-AS3+anti-miR-216a-5p组miR-216a-5p水平显著下降，A549细胞活性和细胞划痕愈合率升高，迁移和侵袭细胞数增多，Ki-67、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin水平升高，E-cadherin水平降低（P＜0.05）。

图4 lncRNA HOXC-AS3与miR-216a-5p的靶向结合位点Fig.4 Binding sites of lncRNA HOXC-AS3 targeting with miR-216a-5p

表5 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Tab.5 Dual luciferase reporter assay（±s，n=9）

表5 双荧光素酶报告实验（±s，n=9）Tab.5 Dual luciferase reporter assay（±s，n=9）

Note：Compared with miR-con group，1）P＜0.05.

Groups miR-con miR-216a-5p t P WT-HOXC-AS3 0.99±0.10 0.59±0.071）9.831 0.000 MUT-HOXC-AS3 1.14±0.16 1.22±0.15 1.094 0.290

表6 沉默和过表达HOXC-AS3对miR-216a-5p表达的影响（±s，n=9）Tab.6 Effects of silence and overexpression of lncRNA HOXC-AS3 on expression levels of miR-216a-5p（±s，n=9）

表6 沉默和过表达HOXC-AS3对miR-216a-5p表达的影响（±s，n=9）Tab.6 Effects of silence and overexpression of lncRNA HOXC-AS3 on expression levels of miR-216a-5p（±s，n=9）

Note：Compared with silence control group，1）P＜0.05；compared with overexpression control group，2）P＜0.05.

Groups silence control si-HOXC-AS3 overexpression control pcDNA-HOXC-AS3 F P miR-216a-5p/U6 0.98±0.13 4.27±0.351）1.03±0.09 0.35±0.052）750.998 0.000

图5 Western blot检测肺癌细胞Ki-67、Cyclin D1、MPP-2、MPP-9、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达Fig.5 Expression of Ki-67，Cyclin D1，MPP-2，MPP-9，E-cadherin，N-cadherin and Vimentin proteins in lung cancer A549 cells detected by Western blot

表7 沉默HOXC-AS3和过表达miR-216a-5p对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Tab.7 Effects of silencing HOXC-AS3 and overexpressing miR-216a-5p on proliferation，migration and invasion of lung cancer A549 cells（±s，n=9）

表7 沉默HOXC-AS3和过表达miR-216a-5p对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响（±s，n=9）Tab.7 Effects of silencing HOXC-AS3 and overexpressing miR-216a-5p on proliferation，migration and invasion of lung cancer A549 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-HOXC-AS3+anti-miR-con group，1）P＜0.05.

Groups si-HOXC-AS3+anti-miR-con si-HOXC-AS3+anti-miR-216a-5p F P miR-216a-5p/U6 1.03±0.14 0.69±0.081）6.326 0.000 Cell viability（%）101.45±8.67 153.28±12.371）10.293 0.000 Cell migration number 128.68±11.26 163.63±13.341）6.006 0.000 Cell invasion number 46.47±5.39 71.66±6.821）8.693 0.000 Cell scratch healingrate（%）73.73±4.96 82.87±5.641）3.651 0.002

3 讨论

研究表明，lncRNA通过调节转录、翻译和翻译后水平基因表达和功能发挥多种生物学功能，广泛参与癌症、代谢紊乱和心血管疾病等疾病发病过程。lncRNA HOXC-AS3是一种最近新发现的ln⁃cRNA，位于染色体12q13.13区域，是HOXC10的反义转录本，HOX基因对形态发生和发育至关重要［10-11］。BHATLEKAR等［12］研究发现，HOXC家族基因表达在多数实体肿瘤中上调，HOXA9和HOXB13最常发生失调，HOXA常在乳腺癌和卵巢癌中异常表达，HOXB在结肠癌中异常表达，HOXC基因在前列腺癌和肺癌中表达失调，HOXD基因在结肠癌和乳腺癌中表达失调。HOX基因lncRNA的产生可能在肿瘤发生中起重要作用。胃癌中ln⁃cRNA HOXC-AS3通过与YBX1结合介导胃癌发生［5］。lncRNA HOXC-AS3可促进胶质母细胞瘤增殖、迁移和侵袭，靶向结合miR-3922-5p促进乳腺癌转移［6-7］。lncRNA HOXC-AS3在肺癌中的表达尚未明确。本研究发现，lncRNA HOXC-AS3在肺癌组织和肺癌H1299、A549和GLC-12细胞中表达上升，而沉默lncRNA HOXC-AS3表达可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭，过表达lncRNA HOXC-AS3则结果相反，提示lncRNA HOXC-AS3在肺癌发展中具有重要作用。

本研究通过starBase预测发现，lncRNA HOXCAS3与miR-216a-5p存在结合位点。miR-216a-5p在食管鳞状细胞癌（ESCC）中表达下调，靶向TCTN1可抑制ESCC细胞增殖并诱导其凋亡［13］。miR-216a-5p在乳腺癌组织和细胞中表达下降，上调其表达可靶向p21激活蛋白激酶2（PAK2）抑制癌细胞增殖、克隆形成、侵袭和迁移［14］。研究表明，miR-216a-5p在SCLC中表达下调，miR-216a-5p通过Bcl-2家族蛋白调控SCLC细胞增殖、迁移和细胞周期［8］。本研究发现，miR-216a-5p在肺癌组织和肺癌H1299、A549和GLC-12细胞中表达下调，与上述研究既往研究结论一致。双荧光素酶报告系统结果表明，lncRNA HOXC-AS3可靶向负调控miR-216a-5p表达，干扰miR-216a-5p可部分逆转沉默lncRNA HOXC-AS3对A549细胞恶性行为的抑制作用，证实肺癌A549细胞中lncRNA HOXC-AS3和miR-216a-5p存在调控关系。

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transi⁃tion，EMT）可促进肿瘤细胞癌变，针对肺癌表皮生长因子受体（EGFR）的靶向治疗即是通过抑制EMT实现对肺癌的抑制作用［15］。本研究发现，沉默ln⁃cRNA HOXC-AS3可抑制A549细胞EMT，而过表达lncRNA HOXC-AS3和干扰miR-216a-5p则逆转这一作用。

综上，本研究发现，肺癌组织和肺癌H1299、A549和GLC-12细胞中lncRNA HOXC-AS3表达上调，miR-216a-5p表达下调，肺癌A549细胞中ln⁃cRNA HOXC-AS3可靶向miR-216a-5p调控细胞增殖、迁移、侵袭和EMT，lncRNA HOXC-AS3可能是NSCLC的分子靶点。