南亚楠 李亚东 吴 珺 郝 钰 杨明锐（北京中医药大学生命科学学院，北京100029）

流感病毒是一种强传染性的呼吸道病毒，可导致流行性感冒（简称流感），患者出现咳嗽、发热、头疼、乏力等症状，严重者常发展为病毒性肺炎，甚至死亡［1］。流感病毒感染可引发机体“细胞因子风暴”，导致肺部炎症反应［2］。其中，IL-6在感染早期的固有免疫阶段即可生成，是主要的促炎细胞因子，其水平高低与流感后肺炎严重程度相关［3］。干扰素（interferon，IFN）-γ、IL-10及IL-17A主要分别由流感病毒诱导机体Th1、Th2/Treg及Th17细胞分泌，以发挥不同T细胞亚群的免疫效应，其表达水平与肺部炎症程度呈正相关［3-4］。趋化因子CCL25则通过与特异性受体CCR9结合，介导T淋巴细胞定向迁移及组织浸润［5］。以上细胞因子的生物学效应最终导致肺部免疫损伤及肺炎发生发展。

胃肠型流感还包括腹痛、恶心、呕吐和腹泻等类似肠胃炎的并发症，儿童感染者尤为严重［6］。WANG等［7］在小鼠模型中验证了流感病毒导致小肠免疫损伤及结肠缩短的现象，并揭示肺源CD4+T细胞可特异性迁移至肠道，破坏肠道菌群稳态。张淑静等［8］与王惠娴等［9］研究发现，流感病毒感染后肠道病变可累及小肠及大肠组织。流感病毒感染引发肺、肠损伤的机制尚未明确，但肺脏与肠道的病理相关性与中医脏腑理论体系中“肺与大肠相表里”内容相符，提示流感治疗过程中应考虑选用对肺脏、肠道均具有保护作用的药物。

小檗碱又称黄连素，是从中草药黄连等植物中提取的异喹啉类生物碱，具有多种药理作用，临床多用于治疗细菌性痢疾、急性肠胃炎等消化道感染［10］。研究表明，在小鼠流感病毒性肺炎的体内模型中，小檗碱对病毒性肺炎具有较好的治疗作用，可有效降低死亡率、延长生命、改善肺组织炎症病变［11-13］。因此，小檗碱对肠道炎症和肺部炎症均有一定治疗作用，但其是否对流感病毒感染导致的肺、肠损伤均具有保护作用尚未阐明。本研究构建小鼠模型，探讨小檗碱对流感病毒感染导致肺、结肠损伤的保护作用，并从细胞因子和肠道菌群角度初步探讨其作用机制，为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与病毒株 SPF级BALB/c雄性小鼠，体重13～15 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司（合格证号：1103242011006477）；H1N1流感病毒A/Puerto Rico/8/34鼠肺适应株（简称PR8）为北京中医药大学生命科学学院免疫与微生物学教研室实验室冻存，采用Reed Muench法计算PR8对小鼠的半数致死量（LD50）为10-2.68［14］。病毒实验及相关操作均在动物实验安全二级实验室（BSL-2）进行。

1.1.2 药物与试剂 小檗碱购自中国药品生物制品检定所；利巴韦林注射液购自河北石家庄石药集团欧意药业；IL-6、IL-17A及IFN-γELISA检测试剂盒购自BioLegend公司；RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司；反转录试剂盒、SYBR Green实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒均购自TaKaRa公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.2 方法

1.2.1 造模、给药及取材 BALB/c小鼠随机分为4组：正常组（N）、病毒模型组（M）、利巴韦林组（阳性对照组，P）及小檗碱组（BER），每组8只。乙醚轻度麻醉下，滴鼻给予25µl 5 LD50流感病毒PR8毒株构建感染模型，对照组滴鼻给予等体积生理盐水。病毒感染2 h后腹腔注射给予小檗碱（5 mg/kg），利巴韦林（100 mg/kg），0.2 ml/(只·d)，其他组注射给予等体积生理盐水。每天记录小鼠一般生存状况、死亡率和体重。感染后第6天，小鼠眼球取血，杀剖小鼠，取肺脏、结肠组织，称重，计算肺指数及肺指数抑制率：肺指数=肺重（g）/体重（g）×100%，肺指数抑制率=（模型肺指数均值-治疗组肺指数均值）×模型肺指数均值×100%。

1.2.2 ELISA检测血清细胞因子水平 取血后室温放置2 h，4℃放置2 h至血液凝固，4℃、3 000 r/min离心10 min，取上清，弃不溶物，重复离心1次，分离血清后分装，按ELISA试剂盒说明书检测细胞因子IL-6、IL-17A和IFN-γ水平。

1.2.3 小鼠肺脏RNA提取及反转录 TRIzol法提取小鼠肺脏细胞总RNA，分析RNA纯度及完整性，确定RNA质量合格后，采用M-MLV反转录试剂盒进行反转录，生成cDNA，采用SYBRGreen RT-qPCR试剂盒检测细胞因子IFN-γ、IL-10和CCL25转录水平，以GAPDH为内参，反应体系20µl，操作按试剂盒说明书进行。

1.2.4 粪便肠道菌群16SrRNA测序 病毒感染后第5天，在超净台中采集小鼠新鲜粪便于无菌冻存管，每组5个样本，由奥维森基因科技有限公司采用Illumina MiSeq测序技术测定16SrRNA V3-4区序列，并对群落结构和优势菌群进行比较分析。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism Software 5.0软件进行统计学分析并作图，计量资料以±s表示，两组独立样本均数比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

表1 RT-qPCR检测使用引物Tab.1 Primersused for RT-qPCR

2 结果

2.1 小檗碱对流感病毒感染小鼠一般情况及体重的影响 正常组小鼠皮毛顺滑、有光泽，行动和反应敏捷，进食及大便情况正常，体重逐渐增加。模型组小鼠在感染流感病毒4 d后，出现耸毛、蜷缩、毛无光泽，活动减少、食量减少，大便湿度提高，体重逐渐下降（图1），最终死亡2只。利巴韦林组与小檗碱组小鼠全部存活，皮毛、活动和进食情况比模型组有所改善；利巴韦林组小鼠体重有回升现象，而小檗碱则对小鼠体重下降有一定减缓作用，呈现与利巴韦林相似的治疗效果（图1）。利巴韦林和小檗碱均可改善小鼠大便稀溏情况。

2.2 小檗碱对流感病毒感染小鼠肺指数的影响 课题组前期研究已证明小檗碱可有效改善小鼠肺组织炎症病变，对小鼠流感病毒性肺炎疗效较好［11］。为验证小檗碱对流感病毒性肺炎的治疗作用，本研究取小鼠肺脏后观察其病变情况，称量肺脏重量后计算肺指数及肺指数抑制率，结果显示，正常组小鼠肺脏表面呈淡红色，无明显瘀斑、瘀点；模型组小鼠肺脏呈暗红色，可见大片状肺实变病灶，由于充血水肿，肺指数明显升高；利巴韦林组小鼠肺脏表征与正常组相近，可显著降低感染小鼠肺指数（P＜0.000 1），肺指数抑制率为41.59%；小檗碱组小鼠肺脏虽然可见少量分散点状肺实变病灶，但整体呈淡红色，病变明显轻于模型组，且小檗碱可降低小鼠感染后肺指数升高，与模型组差异显著（P＜0.05），肺指数抑制率为20.34%（图2）。

2.3 小檗碱对血清细胞因子IL-6、IL-17A和IFN-γ水平的影响 流感病毒感染6 d后，ELISA检测结果显示，模型组小鼠血清细胞因子IL-6、IL-17A和IFNγ的水平显著升高，利巴韦林可显著降低血清细胞因子IL-6（P＜0.000 1）、IL-17A（P＜0.05）和IFN-γ（P＜0.000 1）水平。而小檗碱对流感病毒感染后血清IL-6和IL-17A的抑制作用无统计学意义（P＞0.05），但小檗碱可显著降低感染小鼠血清IFN-γ水平（P＜0.05，图3）。

2.4 小檗碱对肺脏细胞因子IFN-γ、IL-10和CCL25转录水平的影响 为进一步研究小檗碱对流感病毒感染后肺部的保护作用机制，对各组小鼠肺脏细胞因子IFN-γ、IL-10和CCL25 mRNA水平进行检测，结果显示，与正常组相比，模型组小鼠肺部IFN-γ、IL-10和CCL25转录水平明显升高；利巴韦林可显著降低IFN-γ（P＜0.000 1）、IL-10（P＜0.000 1）和CCL25（P＜0.05）mRNA水平；小檗碱也可显著抑制IFN-γ（P＜0.000 1）、IL-10（P＜0.000 1）及CCL25（P＜0.01）mRNA转录水平（图4）。

图1 小檗碱对PR8病毒感染小鼠体重的影响Fig.1 Effect of berberine on body weight of mice with PR8 infection

图2 小檗碱对PR8感染小鼠肺指数的影响Fig.2 Effect of berberine on body weight of mice with PR8 infection

图3 小檗碱对PR8感染小鼠血清细胞因子IL-6、IL-17A和IFN-γ水平的影响Fig.3 Effect of berberine on cytokines IL-6，IL-17A and IFN-γlevels in serum of mice with PR8 infection

图4 小檗碱对PR8感染小鼠肺脏细胞因子IFN-γ、IL-10和CCL25 mRNA水平的影响Fig.4 Effect of berberine on mRNA levels of cytokines IFN-γ，IL-10 and CCL 25 in lung of mice with PR8 infection

图5 小檗碱对PR8感染小鼠结肠长度和重量的影响Fig.5 Effect of berberine on colon length and weight of mice with PR8 infection

图6 小檗碱对PR8感染小鼠肠道菌群的影响Fig.6 Effect of berberine on gut microbiota in mice with PR8 infection

2.5 小檗碱对流感病毒感染小鼠结肠长度和重量的影响 为评估小檗碱对流感病毒感染后肠道的保护作用，测量各组小鼠结肠长度和重量，结果显示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠平均结肠长度缩短，重量减轻，证实流感病毒H1N1亚型感染对结肠的损伤作用。利巴韦林可显著改善小鼠结肠缩短（P＜0.01）及重量减轻情况（P＜0.05）。小檗碱可维持感染小鼠结肠长度（P＜0.001）和重量（P＜0.05，图5）。提示小檗碱对流感病毒感染引起的结肠损伤具有一定保护作用。

2.6 小檗碱对流感病毒感染小鼠肠道菌群的影响 为探讨肠道菌群在小檗碱结肠保护效应中的作用，对正常组、模型组和小檗碱组小鼠粪便肠道菌群16SrRNA V3-4区进行测序，结果显示，Shan⁃non多样性曲线平稳，表明样品中大部分多样性已被检测（图6A）；韦恩图显示，15个样本中共获得874个有效操作分类单元（OTUs），其中3组共277个，正常组和模型组共307个，模型组和小檗碱组共555个，正常组和小檗碱组共314个（图6B）；基于未加权Unifrac距离算法的非度量多维尺度（NMDS）分析显示，3组样本存在差异，小檗碱组水平更接近于正常组，说明小檗碱可影响模型组小鼠肠道菌群整体结构趋向于正常组小鼠肠道菌群结构变化（图6C）。通过线性回归分析（LDA）和进化分支统计各组有显著作用的微生物类群和生物标志性差异物种，发现小檗碱组区别于其他2组的优势菌群为Ru⁃minococcaceae（瘤胃菌科，图6D、E）。

3 讨论

2019年12月，新型冠状病毒肺炎（COVID-19）爆发，对全国乃至全世界人民健康造成极大危害，导致此次肺炎感染的病原体，新型冠状病毒2019-nCoV，与SARS病毒、流感病毒均属于呼吸道病毒，大部分重症患者会产生以肺炎为主的呼吸系统症状。同时，临床发现部分新型冠状病毒肺炎患者出现腹痛、腹泻等呼吸道外症状，与胃肠型流感患者类似［15-16］。动物实验研究也证实小鼠流感病毒性肺炎模型中存在特异性肠道病变，累及小肠及大肠组织［7-9］。提示呼吸道感染病理损伤过程与肺、肠相关。

小檗碱是黄连、黄柏等植物中提取的异喹啉类生物碱，是获得FDA认证（FDA UNII：0I8Y3P32UF）的补充膳食，具有显著抗菌作用，广泛用于腹泻、痢疾、胃肠炎等消化道疾病治疗。近年小檗碱因被发现具有多种药理作用，如抗糖尿病、抗癌、抗纤维化、抗氧化和抗炎，逐渐成为研究热点［17-19］。流感病毒性炎症治疗中，前期发现小檗碱对流感病毒性肺炎具有有效保护作用［11］。说明小檗碱对消化道及呼吸道炎症具有一定疗效。考虑到呼吸道病毒感染“肺肠同治”的基本原则和小檗碱的药理作用，本文研究小檗碱是否可保护流感病毒引发的肺与结肠损伤。

首先，证实小檗碱对流感病毒感染小鼠整体水平具有保护作用，避免过度炎症反应：降低死亡率，维持体重和正常行为；其次，证实小檗碱对肺部的保护作用：减轻肺部病变，抑制感染后肺指数升高。流感病毒感染后肺炎的重要表征为细胞因子过度表达而出现“细胞因子风暴”，促炎与抗炎细胞因子相互作用导致肺组织水肿、肺毛细血管渗漏及炎症细胞渗出，加速肺组织损伤［3］。课题组前期已发现小檗碱可通过抑制细胞间黏附分子（intercellular cell adhesion molecule，ICAM）-1、血管内皮黏附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM）-1表达及减少肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、单核细胞趋化蛋白（monocyte chemotactic pro⁃tein，MCP）-1、IL-1β和IL-18产生治疗流感病毒性肺炎［12，20］。

为进一步研究小檗碱的作用机制，课题组选取其他细胞因子作为检测对象，IL-6和IFN-γ是病毒感染后固有免疫阶段大量释放的细胞因子，均为体内主要的促炎细胞因子，其水平与流感后肺炎严重程度呈正相关［2-4］。而在适应性免疫应答阶段，T淋巴细胞在趋化因子CCL25作用下，向肺部定向迁移并发生组织浸润［5，7］，而后不同CD4+T细胞亚群分泌不同细胞因子发挥效应，IFN-γ是Th1细胞最重要的细胞因子，可激活巨噬细胞、促进病毒清除，与病毒感染后炎症反应和肺损伤有关。IL-10可由Th2和Treg产生，Th2通过IL-10促进体液免疫应答，而Treg通过分泌IL-10起抑制炎症的负调控作用。IL-17A主要由Th17细胞产生，为多效性细胞因子，可作用于多种细胞以促进炎症分子表达［2-4］。本研究检测到流感病毒感染后小鼠血清IL-6，IL-17A及IFN-γ水平与肺脏IFN-γ、CCL25及IL-10转录水平均急剧升高，而小檗碱对以上细胞因子升高均具有抑制作用，尤其是对IFN-γ、CCL25及IL-10的抑制效果尤其显著，可避免病毒感染后失控的“细胞因子风暴”损伤。

同时，本研究发现小檗碱对流感病毒感染导致的结肠损伤也具有一定保护作用：改善大便稀溏情况、维持结肠长度及重量。课题组最初从小檗碱通过抑制炎症细胞因子保护结肠的角度进行研究，检测各组小鼠结肠IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平，未见显著差异。WANG等［7］认为流感病毒感染激活的肺脏CD4+CCR9+T细胞在CCL25作用下向肠道迁移，可能通过分泌炎症细胞因子IFN-γ改变肠道菌群组成，促进Th17细胞及IL-17产生，导致肠道炎症损伤。本研究从肠道菌群角度分析，发现小檗碱对肠道菌群结构和优势菌群具有调节作用。菌群丰富及更多的瘤胃菌科细菌是有效治疗癌症的肠道菌群特征［21］；临床案例也证实，提高肠道菌群多样性及益生菌数量可有效治疗流感病毒感染［22］；据此，课题组推测小檗碱可能通过抑制T细胞过度激活与迁移，同时调节肠道菌群整体结构及优势菌种发挥肺、结肠保护作用。

治疗呼吸道病毒感染不仅要针对病毒，更重要的是对病毒感染后的机体进行有效的整体调节。本研究证实小檗碱对流感病毒感染导致的肺部、结肠损伤均有一定保护作用，并发现小檗碱可显著抑制IFN-γ、IL-10和CCL25产生，同时调节肠道菌群整体结构及优势菌种，保持病毒感染过程中免疫细胞激活及功能平衡，避免“细胞因子风暴”引发的过度炎症反应，发挥肺、结肠保护作用。本研究为小檗碱的临床应用提供了实验证据，同时提倡流感病毒、新型冠状病毒等呼吸道病毒感染治疗过程中应广泛采用肺肠同治的方法。