刘亚东 李 刚 卢小伟（湖北省十堰市国药东风总医院，十堰442000）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种与年龄密切相关的退行性疾病，也是导致老年人残疾的重要原因［1-2］。随着我国老龄化的加剧，其发病率明显升高，已成为备受关注的社会问题［3-4］。目前，OA的发病机制尚不完全清楚，但与晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）诱导的软骨细胞损伤密切相关。AGEs是非酶糖基化反应的最终产物，可通过诱导软骨细胞凋亡、软骨基质降解、促进软骨细胞炎症和氧化应激反应等促进OA的发生［5］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类非编码RNA，可通过调控软骨细胞凋亡、炎症反应和氧化应激等参与OA的发生发展［6-8］。miR-31是miRNAs家族成员，被证实其过度表达可减轻炎症反应和氧化应激诱导的神经损伤［9］。有研究指出，miR-31在OA患者软骨组织中表达下调，其过表达可通过靶向调控C-X-C基序趋化因子配体12表达促进软骨细胞增殖［10］。然而，其对AGEs诱导的软骨细胞损伤的影响并不清楚。本研究通过观察上调miR-31表达对AGEs诱导的软骨细胞凋亡、炎症和氧化应激的影响，以揭示miR-31在OA发生发展中的作用，为OA的治疗提供新线索。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠软骨细胞（美国ATCC），DMEM培养基（美国Hyclone）；AGEs（美国Biovision）；二甲基亚砜、MTT和胰蛋白酶（美国Sigma）；胎牛血清（杭州四季青）；miR-31模拟物及其阴性对照（上海吉玛公司）；Bcl-2、Bax和GAPDH抗体（美国Abcam）；HRP标记的IgG二抗（北京中杉金桥公司）；TRIzol试剂和转染试剂Lipofectamine®2000（美国Invitro⁃gen）；青链霉素双抗和Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（北京索莱宝公司）；IL-1βELISA试剂盒和TNF-αELISA试剂盒（武汉伊艾博生物公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、逆转录试剂盒和Caspase-3活性检测试剂盒（上海碧云天公司）；SOD、MDA试剂盒（南京建成公司）；LX-800酶标仪（美国Bio-Tek），CO2细胞培养箱（美国Thermo）；FACSCantoⅡ流式细胞仪（美国BD）。

1.2 方法

1.2.1 软骨细胞培养、分组与处理 采用含1%青链霉素双抗和10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%CO2细胞培养箱内常规培养大鼠软骨细胞。将对数生长期的软骨细胞按照2×105个/孔接种至6孔细胞板上后，置于细胞培养箱中常规培养。实验分为对照组：正常培养；AGEs组：给予100µg/ml AGEs作用3 d［11］；AGEs+miR-NC组：转染阴性对照后给予100µg/ml AGEs作用3 d；AGEs+miR-31组：转染miR-31模拟物后给予100µg/ml AGEs作用3 d。其中，每组设置3个复孔。待细胞达70%融合度时，参照Lipofectamine®2000说明书将miR-31模拟物和阴性对照转染至AGEs+miR-31组和AGEs+miR-NC组细胞中。转染5 h后，更换新鲜培养基继续培养24 h。经AGEs处理后，收集各组细胞进行后续实验。

1.2.2 RT-PCR法检测细胞中miR-31表达水平 采用TRIzol法提取软骨细胞总RNA后，参照逆转录试剂盒说明书将RNA合成单链cDNA。以cDNA为模板，根据上海生工生物工程合成的引物上PCR仪进行扩增，U6为管家基因，采用2-ΔΔCt法计算细胞中miR-31的表达水平。其中，PCR反应条件如下：95℃预变性5 min后，进入40个循环阶段：95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s。PCR扩增引物序列如下：U6上游：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCG⁃GCAGC-3′，下游：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-31上游：5′-CTCGGATCCTGTGCATAACT⁃GCCTTCA-3′，下游：5′-CACAAGCTTGAAGTCAGGGCGAGACAGAC-3′。

1.2.3 MTT法检测细胞活力 将对数生长期的各组软骨细胞按照每孔1×106个接种至96孔细胞板上后，置于细胞培养箱中常规培养。待细胞贴壁后，按照1.2.1中的方法分组并处理细胞，另外将无细胞的培养基作为空白调零组。处理结束后，向各组细胞中加入20µl MTT试剂（浓度5 g/L）孵育4 h。弃上清液后，每孔加入150µl二甲基亚砜；摇床震荡反应15 min后，采用酶标仪检测各组细胞在570 nm处的OD值，并以（实验组OD组-调零组OD值）/（对照组OD组-调零组OD值）×100%表示各组细胞存活率，实验重复3次。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 胰蛋白酶消化收集对照组、AGEs组、AGEs+miR-NC组和AGEs+miR-31组细胞后，以预冷的磷酸缓冲液洗涤细胞2次。加入结合缓冲液重悬细胞后，向100µl细胞悬液（含105个细胞）中加入5µl Annexin-V-FITC和5µl PI避光反应15 min。补加上样缓冲液200µl后，在1 h内上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验重复3次。

1.2.5 比色法检测细胞Caspase-3活性 收集AG⁃Es处理结束后AGEs组、AGEs+miR-NC组、AGEs+miR-31组和正常培养的对照组细胞，以磷酸缓冲液洗涤1次。加入细胞裂解液抽提细胞总蛋白后，参照Caspase-3活性检测试剂盒说明书步骤检测各组细胞Caspase-3活性。实验重复3次。

1.2.6 Western blot法检测细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达水平 向待测的软骨细胞中加入细胞裂解液抽提细胞总蛋白后，采用BCA法检测总蛋白的浓度与纯度。将蛋白样品与等体积上样缓冲液混匀后，置于沸水浴中煮沸5 min。将变性后的蛋白样品按照每孔50µg上样至SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。电泳结束后，电转至PVDF膜上。经5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入按照1：1 000比例稀释的Bcl-2抗体、Bax抗体和GAPDH抗体在4℃下孵育过夜。次日，加入按照1：2 000比例稀释的二抗室温孵育2 h。经化学发光剂显影曝光后，以GAPDH为内参，采用凝胶成像分析系统扫描分析各组细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.2.7 细胞上清液中IL-1β、TNF-α和SOD、MDA含量检测 收集AGEs处理结束后AGEs组、AGEs+miR-NC组、AGEs+miR-31组和正常培养的对照组细胞上清液，参照IL-1βELISA试剂盒、TNF-αELISA试剂盒、SOD试剂盒和MDA试剂盒说明书步骤分别检测各组细胞上清液中IL-1β、TNF-α和SOD、MDA含量。实验重复3次。

1.3 统计学分析 以±s形式表示实验所得数据，采用SPSS22.0软件进行统计学分析，多组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后各组细胞中miR-31表达水平 与对照组比较，给予AGEs处理后软骨细胞中miR-31表达水平明显降低（P＜0.05）；与AGEs组比较，转染阴性对照后软骨细胞中miR-31表达水平无明显改变（P＞0.05）；但转染miR-31模拟物后软骨细胞中miR-31表达水平明显高于AGEs+miR-NC组或AGEs组（P＜0.05）。见图1。

图1 各组细胞中miR-31表达水平的比较Fig.1 Comparison of miR-31 expression levels in cells of each group

2.2 上调miR-31表达对AGEs诱导的软骨细胞活力的影响 与对照组比较，AGEs组软骨细胞存活率明显降低（P＜0.05）；与AGEs组比较，AGEs+miRNC组软骨细胞存活率无显著变化（P＞0.05）；与AG⁃Es组或AGEs+miR-NC组比较，AGEs+miR-31组软骨细胞存活率明显升高（P＜0.05）。见图2。

2.3 上调miR-31表达对AGEs诱导的软骨细胞凋亡的影响 与对照组比较，AGEs组细胞凋亡率和Caspase-3活性显著升高（P＜0.05）；与AGEs组比较，AGEs+miR-NC组细胞凋亡率和Caspase-3活性无明显变化（P＞0.05）；然而，AGEs+miR-31组细胞凋亡率和Caspase-3活性明显低于AGEs组或AGEs+miRNC组（P＜0.05）。见图3。

2.4 上调miR-31表达对AGEs诱导的软骨细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 与对照组比较，AGEs组细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显降低，而Bax蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与AGEs组比较，AG⁃Es+miR-NC组细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达水平均无明显差异（P＞0.05）；与AGEs+miR-NC组或AGEs组比较，AGEs+miR-31组细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显升高，而Bax蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见图4。

图2 各组细胞存活率的比较Fig.2 Comparison of cell survival rate in each group

图3 各组细胞流式细胞仪检测各组细胞凋亡（A）、凋亡率（B）、Caspase-3、Caspase-9活性的比较（C）Fig.3 Comparison of apoptosis（A），apoptosis rate（B），Caspase-3 and Caspase-9 activities in each group by flow cytometry（C）

2.5 上调miR-31表达对AGEs诱导的软骨细胞炎症因子的影响 与对照组比较，AGEs组细胞上清液中IL-1β和TNF-α含量均明显升高（P＜0.05）；与AGEs组比较，AGEs+miR-NC组细胞上清液中IL-1β和TNF-α含量均无明显变化（P＞0.05）；但，AGEs+miR-31组细胞上清液中IL-1β和TNF-α含量均明显低于AGEs组或AGEs+miR-NC组。见图5。

2.6 上调miR-31表达对AGEs诱导的软骨细胞氧化应激指标的影响 与对照组比较，AGEs组细胞上清液中SOD含量明显降低，而MDA含量明显升高（P＜0.05）；与AGEs组比较，AGEs+miR-NC组细胞上清液中SOD和MDA含量均无明显变化（P＞0.05）；与AGEs+miR-NC组或AGEs组比较，AGEs+miR-31组细胞上清液中SOD含量明显升高，而MDA含量明显降低（P＜0.05）。见图6。

图4 Western blot检测各组细胞中Bcl-2和Bax蛋白（A）及统计量结果（B）表达Fig.4 Western blot detection of Bcl-2 and Bax protein（A）and statistical results（B）expressions in each group of cells

图5 各组细胞上清液中IL-1β和TNF-α含量的比较Fig.5 Comparison of IL-1βand TNF-αcontents in super⁃natant of each group

图6 各组细胞上清液中SOD和MDA含量的比较Fig.6 Comparison of SOD and MDA contents in superna⁃tant of cells in each group

3 讨论

miRNAs是一类广泛存在于生物体内的内源性短链RNA，可通过与靶mRNA结合在转录后水平调控相关靶基因的表达，参与细胞增殖、凋亡和免疫应答等过程，与肿瘤、心血管疾病和OA等多种疾病的发生发展密切相关［12-15］。作为miRNAs的重要成员之一，miR-31具有促进瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用，miR-31还可通过抑制炎症细胞因子受体IL-17R和信号蛋白GP130降低小鼠结肠上皮的炎症反应［16-17］。另外，miR-31过表达可通过抑制JAK/STAT3信号通路和下调PKD1蛋白的表达降低炎症因子IL-1β、TNF-α和氧化应激指标MDA含量以及促凋亡蛋白Caspase-3、Bax蛋白的表达，并氧化应激指标SOD含量增加，减轻炎症反应及氧化应激诱导的缺血性脑卒中神经损伤［9］。尽管，已有研究［10］指出，在OA骨关节患者中miR-31表达下调，且miR-31发挥着促进软骨细胞增殖、迁移和增加胶原蛋白表达的作用；但其是否参与炎症或氧化应激介导的软骨细胞损伤并不清楚。

软骨细胞在维持细胞外基质代谢和软骨组织稳态等过程中起着重要作用，而软骨细胞数量减少和外基质代谢紊乱等是OA重要的病理特征［18］。随着年龄的增加，软骨细胞逐渐衰老，导致其代谢能力降低，进而合成软骨细胞基质维持软骨组织功能的能力减弱，促进OA的发生［19-20］。AGEs被认为是导致OA患者患病的分子学基础，正常情况下，AGEs在体内的水平处于一个平衡状态，衰老、糖尿病或者摄入高温食物时可使AGEs水平升高，AGEs可通过与特异性受体结合促进氧化应激、炎症反应，引起软骨细胞凋亡，加重软骨细胞损伤，导致机体病理改变［21］。本研究以AGEs刺激后软骨细胞存活率、SOD含量、Bcl-2蛋白表达水平明显降低，而IL-6、TNF-α、MDA含量和细胞凋亡率、Caspase-3活性、Bax蛋白表达水平升高。结果表明AGEs刺激可加重软骨细胞炎症和氧化应激反应并促进软骨细胞凋亡。这提示，AGEs刺激可引起软骨细胞损伤。此外，AGEs刺激后软骨细胞中miR-31表达水平明显降低。这提示miR-31可能在AGEs诱导的软骨细胞损伤中发挥着重要作用。转染miR-31模拟物成功上调miR-31表达后发现，AGEs诱导的细胞凋亡、炎症反应和氧化应激均明显受到抑制。结果表明，上调miR-31表达可通过抑制细胞凋亡、炎症反应和氧化应激改善AGEs诱导的软骨细胞损伤。这提示，在OA发生发展过程中，miR-31可能通过抑制软骨细胞凋亡、炎症反应和氧化应激发挥着重要的保护作用。

综上所述，本研究初步揭示了miR-31在OA发生发展中的作用，上调miR-31表达可通过抑制AG⁃Es诱导的细胞凋亡、炎症反应和氧化应激起到保护软骨细胞损伤的作用，但其具体的作用机制还有待后续进一步深入探讨。