位小杰，刘东璞，贾诗慧 ，薛 超，卢凤美

(1.佳木斯大学研究生院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

肝脏纤维化的发生机制复杂多样，肝细胞损伤原因不单一，当肝细胞发生炎症坏死刺激后使原本具有储脂功能的细胞肝星状细胞活化转化为肌成纤维细胞，并释放出大量细胞外基质，和其生成和吸收之间的平衡打破,最后形成肝纤维化。因此，肝星状细胞的活化是肝纤维化的关键。实验证明大黄酸具有抗炎，抗纤维化作用。红景天有抗氧化应激和抑制自由基的形成的功效。在本课题在前期实验中得出大黄酸和红景天联合用药对CCl4诱导的肝纤维化有较好的治疗效果，现为探索大黄酸联合红景天对胆汁淤积致肝纤维化的治疗作用，为临床应用提供理论依据。本实验采用BDL肝纤维化模型，观察大黄酸联合红景天对胆汁淤积性肝纤维化治疗作用并对其作用机制做初步探索。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：健康成年SD雄性大鼠40只，180～220g重。进行观察喂养5d，挑出健康和营养状况在同一水平的大鼠进行实验。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

将40只大鼠随机平均分为4组。分别为：假手术组(Sham组)：胆总管游离术后利用同等体积的生理盐水进行灌胃；模型组(Model组)：行BDL术和生理盐水灌胃；大黄酸组(R组)：行BDL术和大黄酸灌胃；大黄酸联合红景天组(RR组)：行BDL术和大黄酸联合红景天灌胃。

1.2.2 肝纤维化模型制备

大鼠肝纤维化模型是利用胆总管双重结扎诱导的肝纤维化模型，将大鼠用4%水合氯醛麻醉后，备皮消毒后开腹，分离胆总管，用0号线双重结扎后从中间剪断胆总管防止再通，生理盐水冲洗后关腹，术后观察后常规喂养。

1.2.3 药物治疗

BDL术后24h后，R组和RR组在造模的同时，给予治疗。R组：按100mg/kg剂量进行灌胃处理。方法：大黄酸用生理盐水搅拌溶解。RR组：将大黄酸红景天用生理盐水溶解后按剂量大黄酸100mg/kg，红景天400mg/kg剂量进行灌胃处理，每周3次，共4周。

1.2.4 进行生化指标的检测

取大鼠眼内眦静脉血采用生化分析仪进行检测AST、ALT、TBIL、DBIL、生化指标检测。

1.2.5 计算大鼠肝体比

按照公式：肝脏体重(g)/大鼠抽血前体重(g)×100%计算肝体比。

1.2.6 大鼠组织病理学观察

将大鼠肝组织用无水乙醇固定后，进行取材，脱水透明，侵蜡，做成蜡块。将蜡块进行切片，捞片，烘干后进行HE染色，使用普通光学显微镜观察肝组织形态，任选5个视野拍照。

1.2.7采用RT-PCR测定α-SMA、Hab18G/CD147mRNA的表达

肝组织提取总RNA，进行反转录并进行RNA的扩增。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠的一般状况

S组大鼠整体状况良好，精神状况佳，饮食正常，体重逐渐增长。二便正常，尿清，大便成形。M组大鼠在手术实施后表现痛苦，姿势呈弓背状，有明显炸毛病态状，精神萎靡嗜睡，饮食量减少，几乎不活动，随后饮食恢复，体重少量增加，大便呈白陶土样。R组大鼠精神可，饮食可，活动量少。RR组大鼠饮食良好，精神状况欠佳，体重持续增长。

2.2 大鼠生化指标

由表1 可以观察到，与S组比较，M组大鼠血清中TBIL、DBIL、ALT和AST水平均显著升高(P<0.05) ，提示BDL模型大鼠的胆道梗阻明显，肝细胞受到严重损害。R组和RRALT、AST、TBIL和DBIL的水平与模型对照组比较,差异均具有统计学意义(P<0. 05)。说明大黄酸和红景天用药能够降低BDL诱导的肝纤维化大鼠的黄疸水平及肝损伤程度。

表1 不同处理方法对大鼠血清生化指标检测结果的影响

2.3 大鼠肝体比

由表2可以看出，各组大鼠肝体比均较S组升高(P<0.05)，说明BDL肝纤维化模型中肝脏有不同程度的损害；R组、RR组肝体比较M组降低(P<0.05)，说明大黄酸单独用药和大黄酸和红景天联合用药均能够降低肝脏损害；RR组较R组肝体比降低，差异有统计学意义(P<0.05)说明大黄酸和红景天两种药物有协同治疗的作用。

表2 不同处理方法对大鼠肝体比检测结果的影响

2.4 大鼠组织病理学观察

切片进行HE染色后，观察假手术组大鼠切片，肝小叶排列整齐，肝细胞形态正常，未发生纤维化。模型组大鼠肝脏肝小叶结构紊乱，肝条索间隙增宽，排列紊乱，伴肝细胞脂肪变，肝小叶间大量纤维胶原大量增生，向小叶间插入，形成纤维变形。大黄酸组肝小叶间有纤维胶原增生，肝细胞大小均一，有少量的脂肪变，纤维化程度减轻。大黄酸联合红景天组纤维组织明显减少，肝组织纤维化程度最轻。上述结果由两名资深病理科医师诊断判定。见图1。

图1 各组大鼠组织学观察(×100)

2.5 实验大鼠肝组织细胞因子α-SMA、Hab18G/CD147 mRNA 表达

为了证实大黄酸联合红景天抗 BDL引起的肝纤维化作用和α-SMA，Hab18G/CD147表达有关，我们测定了大鼠肝组织中的 α-SMA 、Hab18G/CD147m RNA 水平。由表3可以看出与S组相比，各组α-SMA、Hab18G/CD147mRNA 水平显著增高(P<0.05)；与M组相比，R组、RR组α-SMA、Hab18G/CD147mRNA表达显著降低；RR组较R组α-SMA、Hab18G/CD147mRNA表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 大鼠肝组织中细胞因子表达情况

3 讨论

胆汁淤积性肝损伤是威胁人们健康的重要原因之一。慢性胆石症、胆汁淤积性肝炎等均可发展为胆汁淤积性肝纤维化，其特点是以胆管增生、肝细胞坏死、肝脏纤维化为特征的病理过程，目前临床上尚未有行之有效的方法[1,2]。BDL诱导的肝纤维化模型与人类胆汁淤积性肝纤维化病变特点有极大的相似之处，具有造模时间短，成功率高，成活性高等特点。由于胆汁淤积及胆汁酸长期作用于肝脏，肝细胞可出现进行性损伤。胆汁淤积性损伤是肝纤维化、肝硬化的诱发因素[3,4]。在实验中进行胆总管结扎后，出现黄疸，胆管增生，肝细胞坏死，纤维结缔组织增生等病理变化。大黄酸联合红景天给药四周干预后，大鼠肝纤维化程度明显好转。说明大黄酸联合红景天给药对肝纤维化有一定的治疗作用。

肝脏炎症会引起肝实质的损害，当肝脏受到慢性肝损伤的侵害时，肝脏会启动修复的机制，肝纤维化物质会增加，而降解该物质的细胞因子不足或者活性受到抑制从而引起肝纤维化，但是肝纤维化是任何一种肝病走向肝硬化的必经之路，有研究证明肝纤维化是可逆转的[5]。肝纤维化的过程中，检测血清生化指标如 AST、ALT 等都能不同程度地体现出肝脏病变的水平[6]。在实验中我们观察到在肝纤维化造模构造期间，大鼠肝体比，AST，ALT水平与空白组比较均明显升高。说明造模过程中肝细胞损害严重。TBIL、DBIL为胆汁淤积的血清生化指标，与S组相比，M组大鼠TBIL、DBIL值较高，证实胆总管结扎后引起了进行性的肝脏损害。给药四周后，大黄酸组、大黄酸红景天联合用药组与模型组比较，上述指标均降低，肝纤维化程度有所改善。说明在药物的作用下肝脏有一定的自愈能力。肝纤维化过程中，肝星状细胞活化是关键步骤，活化的肝星状细胞表达于α-SMA，BDL肝纤维化类型α-SMA主要表达在门脉区[7]。而有研究证明Hab18G/CD147能够激活肝星状细胞，并在肝星状细胞中表达[8]。使肝组织中胶原纤维增生，细胞外基质分泌和降解平衡被打破，是造成肝纤维化密切相关。当大黄酸和红景天用药后，α-SMA、Hab18G/CD147mRNA 的表达均明显降低，说明大黄酸和红景天作用的基质可能与降低α-SMA、Hab18G/CD147mRNA表达有关。综上所述，大黄酸联合红景天对BDL诱导的大鼠肝纤维化有一定的治疗作用。