干春霞，胡财江，王立甜，高梓琪，李 今， 徐 晶，王宣军,3，盛 军，徐欢欢,3*

(1.云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室，云南 昆明 650201；2.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；3.云南农业大学理学院，云南 昆明 650201；4.云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201)

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

人永生化表皮角质细胞(HaCaT)购于中国科学院昆明细胞库；高糖培养基DMEM/HIGH GLUCOSE(Thermo)；FBS(Foetal Bovine Serum，胎牛血清)购于Biological Industries公司；胰蛋白酶—EDTA消化液(T1300)、青链霉素混合液(P1400)、高效RIPA裂解液(R0010)购于北京Solarbio Life Science公司。

咖啡因(Caffeine)、二甲基亚砜、组织固定液、结晶紫购于美国Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010)购于Beyotime生物技术公司；MMP9抗体(ab76003)、Acetyl-p53抗体(ab109396)购于Abcam公司；p-p38一抗(4511)、p-ERK一抗(4370)、p-JNK一抗(9255)、SIRT3一抗(5490)购于Cell Signaling Technology(CST)公司；二抗Anti-mouse IgG、Anti-rabbit IgG购于R&D Systems公司；细胞质活性氧荧光染料CM-H2DCFDA(C6827)、特异性线粒体超氧化物荧光染料MitoSOX Red(M36008)购于Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 仪器与设备

细胞培养箱(BINDER)；移液器(Thermo)；倒置荧光显微镜(Leica)；Automated cell counter(C10281，Invitrogen)；酶标仪(Thermo)；低速离心机(中佳 SC-3616)。

1.3 方法

1.3.1 氧化损伤细胞模型建立 复苏人永生化表皮角质细胞(HaCaT)，在含有10 %胎牛血清的高糖细胞培养基中培养，置于含5 % CO2、37 ℃的培养箱中，连续传代2次使得细胞生长活力一致且细胞状态稳定。经过前期预实验，使用功率为20 W的UVB紫外照射灯管对贴壁50 %左右的HaCaT细胞进行照射，构建UV诱导的HaCaT细胞氧化损伤模型，辐射剂量为0.53 J·cm-2。实验设4组处理：处理1(咖啡因0 μg·mL-1、无UV照射)、处理2(咖啡因0 μg·mL-1、UV照射)、处理3(咖啡因50 μg·mL-1、UV照射)和处理4(咖啡因100 μg·mL-1、UV照射)。

1.3.2 结晶紫染色实验 以建立的HaCaT细胞氧化损伤模型为基础，通过结晶紫染色实验检测咖啡因对于细胞生长的影响。各组细胞以80万每皿的细胞密度接种至60 mm培养皿中过夜，待细胞贴壁牢固且细胞密度为50 %左右时对各组细胞进行咖啡因预处理1 h，然后进行UV照射。……