★罗红丽 王舒慧 杜清 管咏梅

（1.焦作市中医院药剂科 河南 焦作 454002；2.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004）

骨关节疼痛是由局部关节软骨劳损和周围关节滑膜持续性炎症引起的，与饮食、生活环境等密切相关。中医认为，常见的关节炎、痛风、肩周炎等各类原因引起的骨关节疼痛均可归属于“痹证”范畴［1］。中医在“痹证”的治疗上早有先例。在《金匮要略》就出现了对关节疼痛的论述，认为引起关节疼痛的主要病机病因是风寒湿邪侵袭机体，主要治法为祛风、除寒、除湿［2］。中药复方对骨关节疼痛尤其是慢性疼痛具有独特的疗效，如汤剂乌头汤、半夏泻心汤［3］，中成药制剂东乐膏［4］等，而中药外用能使药物在特定部位透过皮肤直达关节部位，有利于提高局部药物浓度，与口服给药比较，外用制剂更安全、能更好的保证疗效。

藏药骨关节止痛方为中医临床基本理论为指导临床常用方，由唐古特乌头、川芎、乳香、没药等组成，具有活血散结、止痛消肿作用，临床常现用现配，存在极易污染衣物、使用不便、剂量不准确、黏附力差、疗效不稳定等问题。凝胶贴膏剂是以水溶性高分子材料为骨架材料，与中药或其提取物混匀后涂布于背衬材料上制备而成［5-6］。该剂型不但可以控制药物进入体内的速率，维持平稳的血药浓度，起到长效、缓释作用，还可以降低处方中乌头的毒副作用，还可以直达患处发挥药效，提高角质层水化作用有利于药物透皮吸收等作用［7］。为此，本研究拟将止痛方制备成凝胶贴膏剂，以期为临床提供给药剂量准确、安全有效、临床顺应性好的制剂。

1 仪器与试药

1.1 仪器 CZY-G初黏性测试仪（济南兰光机电技术有限公司）；CZY-6S持粘性测试仪（济南兰光机电技术有限公司）；BLD-200N电子剥离试验机（济南兰光机电技术有限公司）；Anton Paar MCR101流变仪（Anton Paar公司）；搅拌器（德国IKA EUROSTAR digital仪器公司）；Anton Paar MCR101流变仪（Anton Paar公司）；搅拌器（德国IKA EUROSTAR digital仪器公司）；安捷伦7890A GC（Agilent，美国）；Sartorius BS124S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 试药 Viscomate NP-700（由国际特品ISP上海分公司提供）；甘羟铝（批号：SG-0344，日本协和化学有限公司）；甘油（陕西太白山制药有限公司）；柠檬酸、无水乙醇（西陇化工股份有限公司）；CMC-Na（上海山浦化工有限公司）；PEG400（西陇化工股份有限公司）；甘羟铝（批号：SG-0344，日本协和化学有限公司）；聚氧乙烯氢化蓖麻油40（德国BASF公司；肉豆蔻酸异丙酯（中国医药集团化学试剂有限公司）；醋乳香（批号190329，江西江中中药饮片有限公司）；醋没药（批号191227，江西江中中药饮片有限公司）；蜀椒（批号190314，江西江中中药饮片有限公司）；川芎饮片（批号190108，江西江中中药饮片有限公司）；人工麝香（批号：2018VR116，北京联鑫药业有限公司）；Viscomate NP-700（由国际特品ISP上海分公司提供）；双蒸水（自制）。

2 实验及结果

2.1 提取液的制备 将处方中川芎采用10倍量60 %乙醇提取3次，每次2 h，提取液浓缩至一定体积（相当于川芎饮片1 g/mL）；唐古特乌头采取30倍量的0.1 mol/L的盐酸水浸渍12 h后，浸渍液浓缩至一定体积（相当于生药材1 g/mL）；乳香、没药混合挥发油则通过水蒸气蒸馏法提取，适量乙醇溶解，加入相应处方量的人工麝香、川芎及唐古特乌头浓缩液、冰片等，即得。

2.2 凝胶贴膏剂的制备 将甘油、Viscomate NP-700、CMC-Na、PEG400混合，搅拌均匀，将冰片溶解于处方量的的无水乙醇后边搅拌边加入，得到A相；称取甘羟铝与柠檬酸，将药材提取液分次边搅拌边加入，混匀后，加入挥发油及少量乙醇溶解的人工麝香，搅拌均匀，得到B相。将A、B两相混合搅拌均匀，涂布于无纺布背衬上，盖上保护膜，密封保存。

2.3 评价方法［8-10］凝胶膏剂的质量评价多采用初黏力、持黏力、剥离强度和感官评价作为评价指标。本实验以理化指标初黏力、持黏力、剥离强度为主要指标，五项评定标准最后得分总和为总分进行比较确定最佳参数。

2.3.1 初黏力试验按照2020版《中国药典》(四部)通过初黏性测试仪进行评价，使用不同大小钢球从15°高的铺有凝胶贴膏剂的斜板上表面滚过，鉴定初粘力的性能需将最大钢球能否粘住作为标准。以基质粘住的最大号钢球为20分，小一号球的则减1分，按此计分方式计算得分。

2.3.2 持黏性试验取一片凝胶贴膏剂，将具有黏性的一面膏体粘贴在试验不锈钢板表层，沿着凝胶贴膏剂长度的方向，将要求质量的砝码挂在钢板的一端上，读取凝胶贴膏剂滑移直到掉落在底部所需要的时间并且记录。以记录到最长时间为20分，其它则按比例评分。

2.3.3 剥离强度试验取凝胶贴膏剂1片，用具有粘性的胶条将背衬固定在试验板上，将无纺布两端上、下固定在仪器上，以（300±10）mm/min速度进行实验，读取并记录剥离强度（N）。把测定的最大值记为20分，其它则按比例评分。

2.3.4 赋形性试验取一片置于稳定试验箱中40 min（温度：40 ℃，湿度：64 %），放置之后取出，放在与水平面呈60°角的平整钢板上24 h，记录膏体表面是否有变形、滑落现象。根据流淌现象评分为20、15、10、5、0分。

2.3.5 综合感官评分使用盲法评分法对皮肤膜残留、皮肤追随性、膏体性状和透布程度对凝胶贴膏剂进行评判。（1）皮肤追随性：将空白凝胶贴膏剂贴于成人手背表面，均匀用力甩动，进行3次平行实验，一次都都没有掉落的处方记为满分；（2）膏体性状：膏体软硬适中，光滑且细腻、不含气泡者为满分；（3）皮肤膜残留：将凝胶贴膏剂从皮肤表面掀开后，皮肤表面无残留、凝胶贴膏剂膏面不破损者为满分；（4）透布程度：眼睛观察无透布现象者为满分。每个项目满分5分，分数按照等级依次计5、4、3、2、1分。

2.4 单因素试验 固定基质中其他成分的用量不变，改变1种成分的用量，并按“2.2”项下方法制备贴膏剂。进行初、持粘性、剥离强度、赋形性测定，记录相应基质的得分，优选每个因素的最佳用量范围。单因素试验设计及结果见表1。结果表明，影响成型的主要因素有NP-700、CMC-Na、甘油用量，各基质的最佳用量范围分别为Viscomate NP-7001～5 g， CMC-Na 0.5～1.5 g，甘油 15～25 g，柠檬酸1.5～2.0 g，甘羟铝0.1～0.5 g。

表1 单因素筛选结果

2.5 Box-Behnken试验

2.5.1 考察因素与水平经考察发现Viscomate NP-700、甘油以及CMC-Na对基质有着较大影响。考察水平详细见表2。

表2 试验因素与编码

2.5.2 Box-Behnken中心组合优化通过Design-Expert软件安排试验（见表3），制备凝胶基质，对其进行初、持黏性、剥离强度、赋形性测定和综合感官评分，五项评定标准最后得分总和为总分，采用Design-Expert 8.0.6软件进行回归分析，优化出最佳基质配方。

表3 Box-Behnken中心组合试验方案与结果

2.5.3 数据处理根据实验结果，应用Design-Expert8.0软件进行二次多项式逐步回归拟合，得到模型为：

Y=-269.74-32.5775A+35.18967B+96.46333C +0.71AB+0.84AC-2.344BC+3.08583A2-0.4897B2-27.87667C2，模型各项方差结果见表4，试验模型拥有显著性（P＜0.05）。B对基质影响明显（P＜0.01）；模型BC的P值小于0.05，说明B、C间有着互相关联的作用。R=0.9865，说明该模型可以准确对响应值改变进行拟合，且拟合度良好。能够用此模型来探究和推测处方结果，各因素的互相关联结果见图1。

表4 回归模型各项方差分析

图1 AB(A)、AC(B)、BC(C)对基质影响的预测效应面图

2.5.4 优化处方验证各条件因素的交互作用和对得分的影响，均可以通过回归方程直接客观地表示出来，其中拟合曲面的最大值就是凝胶贴膏剂基质最佳处方，为NP-7003.97 g、CMC-Na 0.9 g、甘油21.68 g。考虑到实际操作，将理论值修正为：甘油22 g、水65 g、无水乙醇35 g、PEG4004 g、甘羟铝0.7 g、柠檬酸1.5 g、羧甲基纤维素钠0.9 g、NP7004 g。按上述处方制备3批样品，该处方的凝胶贴膏剂膏体表面光滑无气泡，黏附力各方面良好，没有膜残留，均匀性等其他属性均相对优秀，表明该模型建立的方程可靠。

2.6 凝胶贴膏剂的成型研究

2.6.1 提取液与处方辅料的添加顺序凝胶贴膏剂基质的形成必须经过交联反应才能成型，为了得到均一的基质，药材提取液需在交联反应完成之前加入，因此将处方量的甘油、Viscomate NP-700、CMCNa、PEG400，搅拌均匀，将冰片溶解于处方量的的无水乙醇后边搅拌边加入，得到A相；称取处方量的甘羟铝与柠檬酸，将药材提取液分次边搅拌边加入，混匀后，加入挥发油及少量乙醇溶解的人工麝香，搅拌均匀，得到B相。将A、B两相混合搅拌直至膏体形成，凝胶贴膏剂基质成型时呈棕色均一，具有芳香性且其铺展性良好，说明药材与基质有着良好的相容性。

2.6.2 基质载药量研究采用流变仪测定不同载药量基质的粘弹性参数，从微观的角度研究基质载药量与粘弹性的关系，从而确定基质的最佳载药量。从图2-3可知，随着加入不同量的药材提取液，凝胶贴膏剂基质的G*和η*均比空白基质增加，当载药量为36.0 %时(相当于载75g药材量)，G*和η*最高，随后增加药材用量，其G*和η*显著下降，甚至低于载药量32.0 %(相当于载65 g药材量)，说明药材提取液的加入在一定程度上增加了基质的粘弹性，当载药量为36.0 %时，G*和η*达到较高值，继续增加药材提取液的用量，基质的粘弹性下降，对凝胶贴膏剂的粘附性有较大影响，因此基质的载生药量为36.0 %时较为适宜。

图2 不同载药量凝胶贴膏剂的复数模量变化图

图3 不同载药量凝胶贴膏剂的复数粘度变化图

3 凝胶膏剂透皮行为研究

3.1 HPLC方法学研究

3.1.1 色谱条件色谱柱：菲罗门C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇：1 %冰醋酸（64∶36），流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10 μL，检测波长320 nm。

3.1.2 对照品溶液的制备精密称取阿魏酸、藁本内酯对照品9.60，7.43 mg置于容量瓶中，加甲醇配成含有阿魏酸、藁本内酯7.680，8.916 μg·mL-1的混合对照品溶液。

3.1.3 专属性考察取24 h接受液、空白接受液、阿魏酸及藁本内酯混合对照品溶液按已建立的HPLC色谱条件进样，如图4。结果显示，空白接受液对测定无干扰。

图4 典型色谱图

3.1.4 线性关系考察按“3.1.2”项下方法制备混合对照品溶液，分别进样20，15，10，6，3，1 μL，按本文已建立的色谱条件进行HPLC分析，求得阿魏酸、藁本内酯的线性方程，结果见表4。

表4 线性关系

3.1.5 精密度考察取同一对照品溶液，连续进样6次，结果阿魏酸、藁本内酯峰面积的RSD值分别为0.143 %、1.178 %，结果表明该色谱仪具有良好的精密度。

3.1.6 稳定性试验取同一接受液分别于0、4、8、12、24 h进样，计算阿魏酸的峰面积RSD值为0.81 %，藁本内酯的RSD值为1.59 %，说明接受液在24 h内稳定。

3.1.7 回收率实验取已知含量的24 h接受液1 mL，精密加入对照品溶液1 mL，涡旋混合，取适量注入色谱仪，结果显示阿魏酸的平均回收率为93.8 %，RSD值为2.149 %，藁本内酯的平均回收率为97.4 %，RSD值为6.37 %，说明该方法符合要求。

3.2 离体小鼠皮肤的制备和处理 取适宜小鼠，将其腹部毛剪净，后脱颈椎处死，用眼科剪将小鼠背部皮肤分离，并将其于干净的玻璃板上平铺，便于用棉花蘸取生理盐水去除皮下脂肪和黏液组织去，后洗净，用无菌生理盐水将无破损的完整皮肤冲洗数次，直至将皮肤洗白为止，用铝箔纸包裹，于-20 ℃冰箱中保存，备用。实验前自然恢复至室温，并检查鼠皮的完整性，应保证使用的皮肤无任何破损。

3.3 体外透皮实验 采用改良Franz扩散池，剪取处理好的小鼠皮肤放置于扩散池与接收池间，夹紧，往接收池中加入接受液（乙醇-生理盐水，3∶7），排气泡，使内皮层能与接受液充分完全接触，保持恒温与150 r·min-1，平衡0.5 h。准确称取适量凝胶膏体，使其完全贴于小鼠皮肤表面，更换接收液，保持转速与温度，分别于1、2、4、6、8、10、12、24 h取样1 mL(并补加等体积接受液)，再以0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液进样，以“3.1.1”项下建立的色谱条件测定接受液中阿魏酸和藁本内酯的含量，并计算单位面积累计释放量Q（μg/cm2）。实验平行6份。

3.4 透皮实验结果 药物的累积透皮量Qn的计算公式如下：

其中，A-有效扩散面积（cm2），V-接受液总体积（mL），Cn为第n次取样时接受液中药物的质量浓度（μg/mL），Ci为第i次取样时接受液中药物的质量浓度（μg/mL），Vi为取样体积（mL）；以药物的累积透过量Q（mg·cm-2）为纵坐标，时间t（h）为横坐标，并对Q-t进行模型拟合，同时对曲线中的直线部分进行线性回归，求出的直线斜率即为稳态透皮速率 Js（μg·cm-2·h-1），由结果可知，凝胶贴膏剂中阿魏酸和藁本内酯的24 h累计透过量分别为75.56 μg/cm2、125.39 μg/cm2，渗透速率分别为3.291 μg·cm-2·h-1、5.394 μg·cm-2·h-1，从表5-6可知，该凝胶贴膏剂释药符合零级动力学拟合方程。

表5 凝胶贴膏剂中二种成分的平均累积经皮渗透量Q（，n=6）

表5 凝胶贴膏剂中二种成分的平均累积经皮渗透量Q（，n=6）

时间/h 阿魏酸Q/μg·cm-2 藁本内酯Q/μg·cm-2 10.98±0.27 1.87±0.9823.87±0.84 9.42±3.0349.73±1.71 22.25±4.58617.15±2.25 35.25±5.12824.67±3.03 48.27±5.7610 32.07±3.77 60.23±6.9712 39.14±5.24 73.11±7.9224 75.56±4.36 125.39±12.90

4 讨论

本研究采用Box-Behnken试验设计法对空白基质进行筛选，优化出最佳基质处方。Box-Behnken实验设计法能对3～7个影响因素，在少量的实验次数下，优化出最佳的实验方法。以初、持黏性等物理性质评价和感官评价为测定项目，通过单因素实验，选取Viscomate NP-700、CMC-Na、甘油进行处方筛选，因为多元线性回归拟合方程能客观地反应成分间的交互作用和对响应值变化预测，因此凝胶贴膏剂基质最佳处方为无水乙醇∶CMC-Na∶甘油：PEG400∶甘羟铝∶柠檬酸∶NP700∶水（3.5∶0.09:2.2∶ 0.4∶0.07∶0.15∶0.4∶6.5）。该处方的凝胶贴膏剂膏体表面光滑无气泡，黏附力各方面良好，没有膜残留，均匀性等其他属性均相对优秀，能满足后续制剂的制备。

表6 凝胶膏剂二种成分的体外渗透线性方程及参数

制剂的载药量关乎着给药量的多少，在外用贴膏剂中，给药面积一般是固定不变的，因此在不改变基质性能的前提下，需要提高载药量进而增加药效。凝胶贴膏剂作为一种半固体制剂，其粘弹性是常用来衡量内部基质性能改变的重要流变学参数。本实验尝试着采用流变仪测定不同载药量基质的粘弹性参数，从微观的角度研究基质载药量与粘弹性的关系，从而确定基质的最佳载药量。

对藏药止痛凝胶贴膏剂进行离体透皮实验，结果显示凝胶贴膏剂中阿魏酸和藁本内酯的24 h累计透过量分别为75.56 μg/cm2、125.39 μg/cm2，渗透速率分别为3.291 μg·cm-2·h-1、5.394 μg·cm-2·h-1，透皮效果良好，且给药方便，剂量均匀，能满足外用制剂的要求，可为临床提供相应制剂奠定基础。