张红兵，李俊磊

(河北经贸大学 生物科学与工程学院,河北 石家庄 050061)

微藻是制备生物柴油的优质原料，其表面带有负电荷，在水中易形成稳定的悬浮体系，导致收集较为困难。絮凝法采收微藻具有效率较高、适用范围广、成本较低的优点，逐渐成为微藻工业化开发利用的热点。壳聚糖是一种较为理想的藻类絮凝剂，表面含有大量氨基，在酸性环境下呈阳离子性质，能与微藻发生电中和，形成微小藻团并缓慢沉降[1]。对比氯化铁、氯化铝等金属盐类絮凝剂，壳聚糖无毒易降解，不影响后续产品的加工，但沉降效率较低，往往需要与离心法和过滤法联用。

为了提高微藻采收效率、缩短收获时间，本研究利用壳聚糖与凹凸棒土制备改性絮凝剂，研究壳聚糖与凹凸棒土比例、pH、絮凝剂投加量和沉降时间对絮凝剂絮凝性能的影响，并探究其絮凝机理，为微藻采收提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

小球藻(本实验组筛选保存)，凹凸棒土(工业品，200目)，壳聚糖(BR，脱乙酰度80.0%～95.0%)，其余试剂均为分析纯。

FA1004电子天平;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器;UV-2500紫外可见光分光光度计;pH-3 CpH计;PQX生化培养箱;Zetasizer Nano ZS 90纳米粒径电位分析仪;EVO18扫描电子显微镜。

1.2 絮凝剂的制备

凹凸棒土的酸化预处理：取适量凹凸棒土，用足量的盐酸溶液(2 mol/L)对凹凸棒土进行酸化处理，搅拌过夜，过滤，用蒸馏水淋洗过滤物，直至滤液呈中性，80 ℃烘箱中烘干至恒重，研磨过200目筛，备用。

取3 g壳聚糖、50 mL(1 mol/L)的盐酸溶液加入至100 mL烧杯中，室温搅拌至完全溶解后，各组按设定的壳聚糖与凹凸棒土质量比(1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12)分别添加凹凸棒土，室温下搅拌24 h， 于80 ℃烘箱中烘干至恒重，研磨过200目筛，制得不同质量比的壳聚糖改性凹凸棒土。

1.3 小球藻的培养

BG11培养基成分(g/L)：NaNO3，1.50；Na2CO3，0.02；K2HPO4·3H2O，0.04；MgSO4·7H2O，0.075；CaCl2，0.027 2；EDTA-Na2，0.001；柠檬酸，0.006；柠檬酸铁铵，0.006；微量元素母液，1 mL。其中微量元素母液成分(g/L)：CuSO4·5H2O，0.08；MnCl2·4H2O，1.86；ZnSO4·7H2O，0.22；H3BO3，2.86；Na2MoO4·2H2O，0.39；Co(NO3)2·6H2O，0.05。121 ℃灭菌20 min，冷却至室温备用。

小球藻的培养条件：BG11培养基，pH为7，接种量10%，25 ℃、8000lux下全光照培养，以OD680值来间接测定小球藻的生物量，选用对数生长中后期的小球藻稀释至吸光值为0.100(细胞密度约为2.1×106个/mL)用于实验。

1.4 实验方法

参考杨磊、张高科、汤丹丹等[2]与李凯、刘汉湖、周子森[3]去除铜绿微囊藻的絮凝操作与絮凝率计算方法，取1.3节中稀释后的藻液300～500 mL锥形瓶中，调节pH并投加絮凝剂，300 r/min搅拌2 min， 150 r/min搅拌5 min，静置后在设定时间取液面下2 cm处的藻液测OD680值，重复3次，絮凝率计算公式如下：

絮凝率=(原微藻吸光值-絮凝后液面下2 cm吸光值)/原微藻吸光值×100%

1.5 样品的表征

用扫描电镜对凹凸棒土、改性后的凹凸棒土(絮凝剂)和絮体进行表征。使用纳米粒径电位分析仪测定pH 5下OD680值为0.100的藻液、0.5 g/L的壳聚糖与凹凸棒土质量比为1∶2的壳聚糖改性凹凸棒土和向OD680值为0.100的藻液中投加0.5 g/L壳聚糖改性凹凸棒土获得的絮体的Zeta电位值。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖与凹凸棒土比例对絮凝效果的影响

根据预实验结果，用1 mol/L的HCl溶液和NaOH溶液调节500 mL藻液pH至6，分别投加0.5 g/L 的壳聚糖、凹凸棒土和不同比例的壳聚糖改性凹凸棒土，搅拌、静置、测定2 h和24 h的絮凝率。实验结果见图1，数据表明，壳聚糖改性能够明显提高凹凸棒土对小球藻的絮凝性能和沉降效率，壳聚糖和凹凸棒土的最佳质量比为1∶2，2，24 h的絮凝率从凹凸棒土的5%，11%增加至53%，73%。随着质量比的减小，改性絮凝剂的2 h和24 h絮凝率逐渐减小并趋于稳定，但24 h絮凝率也均超过了58%，对比凹凸棒土的11%提升显著，但低于壳聚糖的92%。考虑到时间成本，确定1∶2为絮凝剂中壳聚糖和凹凸棒土的最佳质量比。

图1 不同比例壳聚糖改性凹凸棒土对絮凝率的影响

2.2 pH对絮凝效果的影响

见图2，pH对絮凝剂的性能影响较大，絮凝剂使用的最佳pH为5。实验结果显示，pH为4.0，5.0时，絮凝剂的絮凝效率较高，2 h絮凝率分别为88.7%，89.0%，24 h絮凝率分别为91.7%，88.1%，壳聚糖中丰富的氨基在酸性弱酸性条件下被质子化，使絮凝剂表面呈阳离子性质，与小球藻发生电中和使其脱稳沉降；pH为3.0时有所下降，可能是强酸性条件下壳聚糖溶解，导致絮凝效率降低；pH为7.0～9.0时，氨基呈非离子或弱负电性，不利于絮凝剂对小球藻的网捕；pH为10时，絮凝率提高，可能是由于培养基中的Ca2+在碱性条件下生成Ca(OH)2，促进了小球藻的沉降[4]。

图2 不同pH对絮凝率的影响

2.3 絮凝剂投加量和沉降时间对絮凝效果的影响

絮凝剂的絮凝效果通常会随着絮凝剂用量的增加和絮凝时间的增长而增强，当絮凝剂的用量和絮凝时间达到一定值时，出现最大值，此时进一步增加絮凝剂用量和延长絮凝时间，提升絮凝效果不明显，有时还会有所下降。由图2可知，改性凹凸棒土的投加量﹤0.5 g/L时，絮凝率随投加量增加而增加，当投加量﹥0.5 g/L时，絮凝效果变化不明显。随着沉降时间的增加，絮凝率不断增大，在2 h左右达到平衡。低于0.5 g/L投加量的实验组受沉降时间影响显著，24 h的絮凝率均高于1.5～2.5 h；投加量≥0.5 g/L的实验组，其絮凝率在2 h时达到最大值并基本不再随沉降时间延长而变化。因此，最终确定0.5 g/L和2 h为最佳投加量与沉降时间。

图3 不同絮凝剂投加量与沉降时间对絮凝率的影响

2.4 Zeta电位测定

分散体系的稳定性常用Zeta电位进行检测，两者的关系见表1[5]。

表1 Zeta电位值与胶体稳定性的关系

检测数据显示，藻液的电位值为(-10.7±2.295) mV，在pH 5的环境下带负电荷，参照表1中Zeta电位值与胶体稳定性的关系，体系在此状态下较为不稳定，实际观察发现，小球藻在静置培养4～7 d后能够缓慢沉降，但轻轻晃动后易恢复到重悬浮状态，这与检测结果相符；絮凝剂的电位值为(5.39±2.56) mV，这是絮凝剂中的氨基在酸性条件下带正电荷，使絮凝剂呈阳离子性质，能够与小球藻作用形成絮体；絮体电位值为(-0.225±3.775)mV，在此状态下体系易快速凝结或凝聚，因此絮凝剂与微藻结合较为紧密，与观测结果一致。

2.5 扫描电镜表征

见图4，图A、B分别是凹凸棒土和絮凝剂的SEM图，在2 μm尺度下，凹凸棒土呈疏松多孔的结构，表面分布大量孔隙，具有较大的表面积，经酸化、壳聚糖改性制成絮凝剂后，空隙数量和大小较改性前增加，说明改性能够增加凹凸棒土表面积，有利于捕获小球藻。图C是絮体的SEM图，可以看出絮凝剂表面吸附了大量小球藻，且两者结合较为紧密。

图4 扫描电镜图

3 结论

微藻采收效率与运作成本直接影响能源微藻的生产周期与产品竞争力。实验结果表明，壳聚糖改性凹凸棒土能够破坏小球藻稳定的分散状态，并利用电中和作用将小球藻吸附，所得絮体紧密、不易重悬浮，在壳聚糖和凹凸棒土质量比为1∶2，pH为5，投加量为0.5 g/L的条件下，2 h时的絮凝率可达88.7%，具备一定的应用潜力。