王 佩， 李盛陶， 王 宁， 高晓冬

（江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

在真核生物中，天冬酰胺（N）连接的糖基化直接影响糖蛋白的结构和生物学功能，是最重要的翻译后修饰过程之一[1-2]。 N-聚糖合成是一个高度保守的多步骤反应过程，首先在内质网膜上组装合成一个多萜醇连接的寡糖前体Glc3Man9GlcNAc2-PPDol（DLO）[3]。 13 个称为Alg 蛋白（天冬酰胺连接的糖基化）的ER 糖基转移酶，催化DLO 的生物合成[4]。 然后在内质网腔内，寡糖基转移酶（OST）的作用下将寡糖部分从多萜醇锚定物上转移到新合成蛋白质的天冬酰胺残基上。 之后，寡糖连接的糖蛋白经历晚期ER 和高尔基体的进一步修饰， 包括选择性去除甘露糖残基并添加N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、半乳糖、唾液酸和岩藻糖残基，随后成熟的寡糖连接的糖蛋白运输到细胞表面或分泌到细胞外[5]。

N-聚糖的合成以及糖蛋白和糖脂的附着装配中的遗传缺陷属于先天性糖基化疾病（CDG）大家族[6]。 目前已经有超过150 种CDG 类型被报道，其中大多数涉及N-糖基化的缺陷[7-8]。 与CDG 相关的疾病异常现象几乎影响每个器官系统[9]。 大多数CDG 表现为常染色体隐性遗传，并具有以下特征的广泛的多系统缺陷，包括神经系统缺陷、发育迟缓、多器官肌张力低下、消化系统异常、腺体功能异常及凝血障碍等[9-11]。

ALG11 位于13 号染色体上并编码甘露糖基转移酶，在内质网外侧以GDP-Man 为底物，将第4 和第5 个Man 转移到DLO 上[12]。ALG11-CDG 源于ALG11 基因的致病变异。 迄今为止，仅12 位患者被确诊为ALG11-CDG[13-17]，见表1。ALG11-CDG 病人虽然都呈现广泛的多系统缺陷，但是不同患者的疾病严重程度并不一样，尤其是存活时间：有些病人很早就死亡；有些病人能存活很多年。 目前对应不同ALG11-CDG 突变的患者疾病严重程度的测定方法主要是通过酵母回补实验， 即将CDG 相关的人Alg11 突变蛋白转入敲除ALG11 基因导致的温度敏感酵母中，观察酵母生长缺陷及低糖基化的回补情况[10]。但是此方法结果显示，酵母生长缺陷的严重程度与病人的严重程度没有很好的相关性，因此需要有一种定量的方法来揭示存在于Alg11 中的不同突变与疾病严重程度的相关性。

表1 ALG11-CDG 病例总结Table 1 Summary of ALG11-CDG patients

Alg11 的底物DPGn2M3 从动植物组织中提取效率低，且DPGn2M3 结构中多萜醇（Dolichol）的碳链较长，导致其合成和纯化难度很高。 具有与多萜醇类似结构而碳链较短的植烷醇（Phytanol）成为体外合成Alg1/Alg2/Alg11 复合体底物DPGn2 中脂肪链部分的首选。 近年来开发出的通过化学法将植烷醇与壳二糖偶联合成出PPGn2 的方法， 为研究N-糖基转移酶性质开辟了新途径[18-19]。 作者所在实验室前期在大肠杆菌中表达了酵母来源的重组蛋白Alg1ΔTM、Trx-Alg2 和Alg11ΔTM， 以PPGn2 为底物，GDP-Man 为糖基供体， 利用化学酶法快速高效的合成PPGn2M5，该底物合成对体外测定人Alg11突变蛋白活性提供了重要的依据[20-23]。

作者尝试在HEK293 和酿酒酵母及大肠杆菌中表达人ALG11-CDG 相关突变蛋白， 并成功在大肠杆菌中大量表达。 结合本实验室开发的体外重构N-糖基化途径中多萜醇寡糖前体的方法， 测定了ALG11-ODG 相对活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 大肠杆菌表达菌株Rosetta DE3 和表达载体pET-28a 质粒： 购于德国Novagen公司；人基因组文库：购于美国Invitrogen 公司；质粒pRS426、pME-hyg：酿酒酵母W303a、人体胚胎肾细胞HEK293：均为作者所在实验室保存，见表2；引物合成及基因测序：由华大基因公司完成。

1.1.2 培养基 大肠杆菌XL10-Gold 使用LB 液体或固体培养基培养； 大肠杆菌表达菌株使用TB培养基培养；酿酒酵母使用YPAD 和SD-Ura 培养；人胚胎肾细胞HEK293 在含有10%胎牛血清的DMEM（dulbecco′s modified eagle medium）中培养。

表2 本研究所用表达系统和ALG11-CDG 突变位点Table 2 Expression system and ALG11-CDG mutation sites used in this study

1.1.3 主要试剂 Primer Star GLX DNA 聚合酶、Ligation Mix DNA 连接酶、2× Taq Master Mix 及限制性内切酶：购自大连宝生物工程公司；SDS-PAGE蛋白质凝胶制备试剂盒： 购自碧云天生物；ClarityTM Western ECL Substrate 显色剂：购自伯乐中国公司；Goat Anti-Mouse IgG HRP、Blue Plus ⅡProtein Marker、1 kb Plus DNA Ladder： 购自北京全式金生物公司；Anti-Flag Mouse mAb、GDP-Man：购自西格玛奥德里奇（上海） 贸易有限公司；SanPrep胶回收试剂盒、SanPrep 产物纯化试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA 小型抽提试剂盒： 购自生工生物工程公司；DMEM-F12 培养基和胎牛血清（FBS）：购自Gibco 公司；其他试剂：均为国产或进口分析纯试剂。

1.1.4 主要仪器 半干电转仪： 购自伯乐中国公司；三重四极杆液质连用仪：购自美国赛默飞世尔科技公司； 液相色谱柱粒径1.7 μm，2.1 mm×100 mm：购自美国沃特世公司；Image QuantTM LAS 4000 mini 显像仪：购自美国通用电气公司。

1.2 方法

1.2.1 表达载体的构建 在NCBI 数据库中下载人类ALG11 的基因序列。引入酶切位点XhoⅠ和KpnⅠ，所有 ALG11 点突变引物根据 Agilent 公司QuikChange Primer Design 在线设计。 以ALG11-Fw和ALG11-Rv（见表3）为引物，以人基因组文库中包含ALG11 基因的单克隆质粒为模板扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。用PCR 产物回收试剂盒回收目的片段，经XhoⅠ与KpnⅠ双酶切，载体用相同的体系进行双酶切， 回收后的片段与载体用ligation mix 连接，转化XL10-Gold 感受态细胞，涂布于LB固体培养平皿上（含100 μg/mL 的Amp），37 ℃培养过夜，挑取单菌落进行菌落PCR 及双酶切电泳图谱鉴定，并测序验证。

表3 本研究所用的引物Table 3 Primers used in this study

1.2.2 蛋白质印记法 取制备的蛋白质溶液40 μL，加入10 μL 5×SDS 蛋白质上样缓冲液， 混匀后于100 ℃煮10 min。 配制12 g/dL 的分离胶和5 g/dL的浓缩胶。 取5 μL 蛋白质样品上样， 电压90 V、30 min，后转为180 V、1 h。 半干法转膜后，5% 脱脂牛奶封闭1 h；一抗Anti-Flag Mouse mAb（1∶3 000），室温孵育2 h； 二抗Goat Anti-Mouse IgG HRP（1∶5 000），室温孵育1 h；用ClarityTM Western ECL Substrate 显 色 液 显 色，Image QuantTM LAS 4000mini 显像系统对结果进行分析。

1.2.3 重组蛋白在人体胚胎肾细胞中表达 首先将细胞接种到6 孔板中，待细胞长到90%时，参照Lipofectamine2000（Invitrogen，USA）的说明书，转染前吸去细胞原有培养基， 加入2 mL 新鲜的完全培养基， 转染时取2 个EP 管，A 管将4 μg pMEALG11-3Flag 野生型及突变体质粒溶于250 μL Opti-MEM 无血清培养基中。 B 管将5 μL lipo2000溶于250 μL Opti -MEM 无血清培养基中， 混匀室温放置5 min。 将A B 两管混合，放置20 min，向培养皿加入EP 管中混好的脂质体，12 h 后换新鲜培养基，24 h 后用胰酶消化保留一半的细胞，48 h 后收集细胞，用1 mL PBS 洗一遍。 向其中加入60 μL裂解液 （150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.1%SDS，1.5 mmol/L EDTA，1%曲 拉 通，1 mmol/L PMSF），混匀，在冰上静置30 min 后于15 000 r/min 离心15 min，参照1.2.2 中的方法检测蛋白质表达。

1.2.4 放线菌酮（Cycloheximide） 追踪实验 转染24 h 后用潮霉素（hygromycin，Invitrogen，USA）筛选2 周， 并用有限稀释法 （limiting dilution cloning，LDC）分离单克隆细胞株，由此获得HEK 293 稳定表达Alg11 及突变蛋白的细胞株。 将100 μg/mL 放线菌酮（Cycloheximide）添加到生长状态良好的细胞中，并分装细胞在添加后的指定时间去除。 收集细胞，参照1.2.2 中的方法检测蛋白质表达。

1.2.5 重组蛋白质在酿酒酵母中表达 接种W303a 到5 mL YPAD 液体培养基中，30 ℃摇床过夜振荡培养至OD660达到1.0 左右，收集菌体，加入100 μL 一步转化液（1 mol/L 二硫苏糖醇（DTT）10 μL，2 mol/L 醋酸锂（LiAc） 10 μL，50%聚乙二醇80 μL）及0.5 ～1 μg 带 有URA3 遗 传 标 记 的 一 系 列pRS316-TEFpr-ALG11-3Flag 野生型及突变体质粒DNA 并振荡混匀， 将混合液置于金属浴加热器中，45 ℃反应30 min；反应结束后，涂布于SD-Ura 平板，待单菌落生长到合适大小后，挑取若干单菌落划线于SD-Ura 平板上，2～3 d 后挑取适量酵母菌接种到SD-Ura 液体培养基中，收集对数生长期的OD为5 左右的酿酒酵母菌体，加入200 μL 8 mol/L 尿素， 并加入和菌体等体积的玻璃珠（425～600 mm，Sigma-Aldrich），涡旋振荡1 min，冰上放置1 min，15 个循环裂解酿酒酵母，释放细胞内蛋白质。 酿酒酵母裂解后于4 ℃下15 000 r/min 高速离心15 min，收集上清液， 蛋白质质量浓度用BCA 试剂盒测定，参照1.2.1 中的方法检测蛋白质表达。

1.2.6 重组蛋白在大肠杆菌中表达 将pET28a-ALG11 质粒转化到Rosetta DE3 大肠杆菌中得到重组菌。 挑取单菌落接种到5 mL LB 培养基 （含50 μg/mL Kan，34 μg/mL Cm）中，37 ℃、220 r/min 过夜培养（约12 h）。按照体积分数1%接种于新鲜TB 培养基中，37 ℃、220 r/min 培养至OD600约0.6 时，将摇瓶移至16 ℃摇床， 取1 mL 菌液作诱导前对照，待培养基温度降低后添加100 mmol/L IPTG，16 ℃培养16 h。 诱导后取1 mL 菌液作诱导后对照，9 000 r/min、4 ℃离心5 min 收集菌体。 收集10 mL菌体重悬缓冲液（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0），将菌体冰浴超声破碎（超声2 s，停2 s，持续2 min）后于4 ℃、4 000 g 离心30 min，弃沉淀，收集上清液。 100 000 g 超速离心60 min，弃上清液， 沉淀重悬于100 μL 缓冲液 （14 mmol/L MES/NaOH，pH 6.0、30%甘油）， 即得到大肠杆菌细胞膜成份。膜成份中总蛋白质质量浓度用BCA 蛋白质质量浓度测量试剂盒进行测定。 取10 μg 上述制备的含膜成份的蛋白质， 参照1.2.1 中的方法检测蛋白质表达。

1.2.7 LC-MS （液质联用） 定量研究ALG11-CDG相关突变的活性 Alg11 重组蛋白的活性测量体系标准的反应条件如下： 底物受体PPGn2-Man3 （50 μmol/L）、糖基供体GDP-Man（2 mmol/L）和含有人Alg11 重组蛋白的大肠杆菌膜成份（20 mg/mL）于缓冲液（14 mmol/L MES/NaOH，pH 6.0，1 mol/L 蔗糖，4 mmol/L 柠 檬 酸 钾，0.05% NP -40，10 mmol/L MgCl2）中，反应体积60 μL，反应在30 ℃下静止孵育8 h 或12 h 后，加入0.2 mL 浓度为20 mmol/L 的HCl 终止反应，并于100 ℃下酸解1 h，释放糖链与脂肪链 （Phytanol）。 酸解产物加入1 mL 体积分数2%的乙腈溶液混匀后，12 000 g 离心1 min，上清液通过1 mL 固相萃取填料Supelclean ENVI-Carb Slurry 进行糖链的纯化，纯化方法参照说明书。 经过填料纯化的糖链于25%的乙腈溶液中洗脱，通过冷冻干燥，最终得到的纯化糖链粉末溶解于40 μL 的纯水中，糖链用液质联用方法进行检测，液相条件为： 流动相A 乙腈， 流动相B 纯水； 梯度：0～2 min，20% B；2～15 min，20%～50% B；15～18 min，50% B；流量：0.2 mL/min，柱温40 ℃。 质谱条件为：正离子模式，检测范围m/z 400～1 600。

2 结果与讨论

2.1 ALG11-CDG 突变蛋白在HEK293 中稳定性研究

首先在同为哺乳动物细胞的HEK293 中表达ALG11-CDG 相关突变蛋白。 用抗Flag-tag 抗体对蛋白质进行Western blot 验证， 从蛋白质电泳图中可知， 在50 000～70 000 之间出现一条明显的蛋白质条带，目的蛋白质的理论相对分子质量为55 600，相对分子质量和预期的大小一致， 表明蛋白质在HEK293 中成功表达，见图1。由于Flag 标签加在蛋白质C 端，c.623-642del 突变产生的210 个氨基酸的截短蛋白在此处的没有检测到。 ALG11-CDG 相关突变蛋白比Alg11 野生型蛋白表达量显著减少，不同Alg11-CDG 突变蛋白表达量也各不相同。这说明ALG11-CDG 突变蛋白在HEK293 中是不稳定的。

图1 ALG11-CDG 相关突变蛋白在HEK293 中的表达及定量分析Fig. 1 Expression and quantitative analysis of ALG11-CDG mutant proteins in HEK293

为了研究是否确实存在ALG11-CDG 蛋白被降解，首先通过CHX 追踪，分析在HEK293 细胞中过表达的具有C 末端Flag 标签的Alg11 野生型及ALG11-CDG L86S 突变蛋白的稳定性。 L86S 蛋白半衰期约为1 h（图2（a）），而Alg11 野生型蛋白的半衰期则长达8 h（图2（b））。 这说明哺乳动物细胞内可能存在某种机制， 如内质网相关降解途径（ERAD），能够准确识别降解ALG11-CDG 蛋白，使哺乳动物细胞HEK293 中不能稳定表达相应蛋白质。

图2 Alg11 蛋白降解追踪Fig. 2 Degradation curve of Alg11 protein

2.2 ALG11-CDG 突变蛋白在酿酒酵母中稳定性研究

ALG11-CDG 突变蛋白在哺乳动物细胞中不稳定，我们研究了其在另一真核生物酿酒酵母中的稳定性。 Western Blot 结果表明，Alg11 及Alg11-CDG突变蛋白在酿酒酵母中成功表达， 见图3。 野生型Alg11 表达量高于6 个突变， 不同突变蛋白表达量也各不相同。 这个结果说明，酿酒酵母存在哺乳动物细胞类似的降解ALG11-CDG 蛋白的机制， 但是和哺乳动物细胞中并不完全相同， 因此ALG11-CDG 突变蛋白在酿酒酵母中不能稳定表达。酵母中ERAD 跟哺乳动物细胞中的不相同， 所以我们看到ALG11-CDG 突变蛋白在这两种细胞内的降解也不相同。

图3 ALG11-CDG 相关突变蛋白在酿酒酵母中的表达及定量分析Fig. 3 Expression and quantitative analysis of ALG11-CDG mutant proteins in Saccharomyces cerevisiae

2.3 大肠杆菌中ALG11-CDG 相关突变蛋白稳定表达

原核细胞没有真核细胞内质网相关降解途径，因此在原核细胞大肠杆菌中表达ALG11-CDG 相关突变蛋白。 蛋白质电泳结果表明，ALG11-CDG 相关突变蛋白在大肠杆菌中成功表达。 其中6 个突变的表达量和野生型基本一致，见图4。 c.623-642del 突变的上样量只有其它突变的1/10，因此该突变跟其它的突变相比表达量极高， 这说明ALG11-CDG 相关突变蛋白成功在大肠杆菌中稳定表达。

2.4 LC-MS 定量分析ALG11-CDG 相关突变的活性

大肠杆菌中稳定表达的突变和野生型蛋白可进行定量活性比较。 测量它们的活性时，加入反应的总蛋白质量一致。反应12 h 后，通过LC-MS 进行检测，结果见图5。c.623-642del 和E398K 完全没有活性；L86S 活性显著降低（UPLC 图很难看到明显的产物峰， 但ESI-MS 显示在13.7 min 和14.7 min 附近分别有中间产物和终产物的相对分子质量产物；G160V 活性也很低；Q318P 活性降低一般；Y279S和L381S 活性相对于野生型降低很少。

双功能酶Alg11 催化的是两个相同糖苷键的Man （α-1，2）， 因此推测两步反应的Km值差别不大，从而反应中很少有中间产物的积累，实验可以通过终产物的转化率来定量Alg11 的活性。 定义ALG11-CDG 相关的突变蛋白的相对活性为： 突变Alg11 的转化率/野生型Alg11 的转化率。 表4 为定量分析7 个突变蛋白的相对活性：病人1（同合子突变L86S）在2 岁时死亡，L86S 突变蛋白只有1.8%野生型的活性，与病人严重的症状相吻合；病人2 为病人1 的弟弟， 后面的临床症状没有报道； 病人3（杂合子突变c.623-642del 和Y279S） 目前7 岁，虽然c.623-642del 没有活性，但是Y279S 突变蛋白仍有83.8%野生型的活性，与病人温和的症状相吻合；病人4（杂合子突变E398K 和L381S）目前4.5 岁，虽然E398K 没有活性， 但是L381S 突变蛋白仍有83.8%野生型的活性，与病人温和的症状相吻合；病人5（同合子突变Q318P）目前8.5 岁，Q318P 突变蛋白仍有38.8%野生型的活性， 与病人温和的症状相吻合；病人6（杂合子突变c.36dupG 和G160V）在4个月时死亡，c.36dupG 没有活性，且G160V 突变蛋白只有5.8%野生型的活性，与病人严重的症状相吻合；病人7（杂合子突变c.45-2A>T 和G160V）在3岁时死亡，c.45-2A>T 可能没有活性， 且G160V 活性极低，定量检测活性的方法显示，ALG11-CDG 相关突变的活性下降程度与疾病的严重程度具有一定的相关性。

图4 ALG11-CDG 相关突变蛋白在大肠杆菌中的表达Fig. 4 Expression of ALG11-CDG mutant proteins in E.coli

图5 LC-MS 定量分析ALG11-CDG 相关突变的活性Fig. 5 Quantitative analysis of the activity of ALG11-CDG mutations using LC-MS

3 结 语

首先在哺乳动物细胞HEK293 和低等真核细胞酿酒酵母中表达ALG11-CDG 相关突变蛋白，发现突变蛋白表达量低于野生型Alg11 蛋白， 不同突变蛋白表达量均有显著差异， 这表明ALG11-CDG突变蛋白不能在真核细胞中稳定表达， 考虑到Alg11 为内质网膜蛋白， 其降解有可能通过ERAD（内质网相关降解）途径的控制。 而在没有ERAD 途径的原核细胞大肠杆菌中，Alg11 野生型及突变蛋白得到了稳定表达。 这一结果有力地支持CDG 突变蛋白通过ERAD 途径被降解的推测。 与此同时，我们的LC-MS 定量分析ALG11-CDG 蛋白活性的结果也证明了ALG11-CDG 突变蛋白的相对活性与疾病的严重程度存在一定的相关性。 因此，大肠杆菌表达的方法可以用于CDG 患者疾病严重程度的预测。 CDG 突变所造成的Alg11 的酶活性与蛋白质稳定性的关联及有关分子机制有待进一步阐明。

表4 ALG11-CDG 相关突变的相对活性总结Table 4 Summary of relative activity of mutations in ALG11-CDG patients