傅 娟，刘媛媛，李 霞

(1.固原市人民医院，宁夏 固原 756000；2.陕西省合阳县人民医院，陕西 合阳 715316；3.西安高新医院，陕西 西安 710075)

血管瘤是以血管内皮细胞增殖为特征的真性肿瘤[1-2]，在婴儿中常见，为先天性良性肿瘤或血管畸形，大部分可自行消退，但也有一少部分因生长在特殊部位而影响到组织或器官功能，严重危及生命[3-4]。所以，血管瘤的治疗是一个不容忽视的问题，也是临床和科研研究的热点。临床上最常用的手术治疗，但风险大、费用高，并不适用所有患者，所以寻找新颖、廉价高效的药物用于临床治疗小儿血管瘤显得极为迫切。小白菊内酯(Parthenolide,PTL)是一种从菊科植物中提取出来倍半萜类化合物，具有独特的抗炎及抗肿瘤的生物活性[5-6]。研究表明，血管瘤增殖的病理学基础是血管内皮细胞无限增殖[7]，因此，抑制血管内皮细胞增殖或诱发血管内皮细胞凋亡是血管瘤自然降解的关键[8]。本研究观察PTL对小儿血管瘤内皮细胞凋亡相关蛋白的影响，为小儿血管瘤的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料 小儿血管瘤内皮细胞购自广州赛业生物科技有限公司。DMEM培养基、血清、青霉素/链霉素均购自Gibco公司，DMEM完全培养基包括10% 磷酸盐缓冲液(PBS),1%青霉素/链霉素。Bax(批号2772s)、Bcl-2(批号3948s)、Cleaved-Caspase 3(批号9664)、Caspase 3(批号9662)单克隆抗体、Tunel细胞凋亡原位检测试剂盒(批号11684817910)、抗体购自美国Cell Signal Technology公司，Cell Titer 96 AQueous 单溶液细胞增殖检测试剂盒 (MTS)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium](货号G3582)购自美国Promega公司。PBS(货号10010-023)购自美国Gibco公司，转膜仪购自美国伯乐公司。实时荧光定量 PCR仪(qTOWER 2.0)购自德国耶拿公司。显微镜(Axiovert 200 MAT AXIOVERT 200 MAT)购自德国蔡司公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MTS法检测PTL对小儿血管瘤内皮细胞活性的影响：小儿血管瘤内皮细胞汇合度达到80% 左右时，消化并重悬细胞，将细胞以1×104/ml密度接种到96孔板中，每孔加入200 μl培养液，次日，加入含有PTL(0、5、10、20、40 μmol/ml)的培养基各180 μl，孵箱中培养24 h 后，每孔中加入20 μl MTS，继续培养4 h后，自动酶标仪测量各孔的吸光度值。

1.2.2 流式细胞仪FITC-AnnexinV+PI双重染色法检测细胞凋亡：将细胞以1×105/ml密度接种到6孔板中，每孔加入2 ml培养液，次日，加入含有PTL(0、5、10、20、40 mg/ml)的培养基各2 ml，孵箱中培养24 h后，消化并收集细胞，预冷1×PBS洗涤细胞两次，弃去上清液，加入490 μl预冷的试剂缓冲液以重悬细胞。按照试剂盒说明进行孵育。将试管放在冰上,在黑暗中孵育10 min。然后使用流式细胞仪测量细胞凋亡，重复实验3次。

1.2.3 Tunel法检测细胞凋亡：赖氨酸提前处理过的玻片放入6孔板，吹干，将内皮细胞悬液(1×104/ml)加入玻片，移至培养器，37 ℃静置3 h，待细胞贴壁后，加入含有或不含PTL的DMEM完全培养基，继续培养24 h，随后，弃掉培养基，PBS洗涤3次，计入1 ml 4%多聚甲醛，固定20 min，之后PBS清洗3次，进行Tunel法检测细胞凋亡，细胞核呈棕色，显微镜下拍照。

1.2.4 蛋白印迹法(Western blot)： 将小儿血管瘤内皮细胞(1×105/ml)接种在6孔板，次日，加入含有或不含PTL的DMEM培养基培养24 h，随后收集细胞，提取蛋白并用BCA试剂盒测定蛋白浓度，进行SDS电泳，每孔蛋白上样量30 μg，用半干转法转膜后，蛋白转移到PVDF膜上，用PBST(含0.5%吐温、20%的磷酸盐缓冲液)洗涤3次后，用5% 脱脂牛奶封闭1 h，加入兔抗人Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、Cleaved-Caspase 3(1∶1000)、Caspase 3(1∶1000)和GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)(1∶1000)一抗稀释液，4 ℃ 在摇床上过夜孵育，次日，加入羊抗兔二抗稀释液(1∶3000)常温下，孵育1 h，用ECL成像仪显色，用Image Lab 5.0分析并统计条带灰度。

1.2.5 实时荧光定量 PCR (qPCR)：将小儿血管瘤内皮细胞(1×105/ml)接种于6孔板中，次日，加入含有或不含PTL的DMEM完全培养基培养24 h，弃掉培养基，加入1 ml Trizol裂解液，反复吹打均匀，提取RNA并用Nano Drop 2000测定RNA浓度，将Prime ScriptTMMaster Mix 试剂盒RNA 进行逆转录，合成cDNA。用TB GreenTMPremix Ex TaqTM进行荧光定量分析，反应程序采用两步法。目的基因引物序列见表1。

表1 基因引物序列

2 结 果

2.1 PTL对小儿血管瘤内皮细胞活性的影响 实验分为：对照组，5、10、20、40 μmol/L PTL组五组(图1)，5、10 μmol/L PTL对小儿血管瘤内皮细胞活性没有显著抑制作用，随着浓度的增加，20、40 μmol/L PTL对小儿血管瘤内皮细胞活性的抑制作用明显增加，与对照组相比，其差异均有统计学意义(均P<0.01)，故本研究选择20 μmol/L PTL用于后续实验。

注：与对照组相比，*P<0.01图1 PTL对小儿血管瘤内皮细胞活性影响

2.2 PTL对小儿血管瘤内皮细胞凋亡的影响 见表2。PTL 10、20 μmol/L对内皮细胞凋亡无显著影响，随着给药浓度的增加，PTL 20、40 μmol/L显著促进内皮细胞凋亡，与对照组相比，差异均有统计学意义(均P<0.01)。 采用细胞爬片的方法进行Tunel法检测细胞凋亡(图2)。PTL显著促进小儿血管肿瘤内皮细胞凋亡，与对照组相比，其差异具有统计学意义(P<0.01)。

表2 五组间细胞凋亡率比较(%)

注：与对照组相比，*P<0.01图2 PTL对小儿血管瘤内皮细胞凋亡影响(Tunel法,×200)

2.3 PTL对小儿血管瘤内皮细胞Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 3和 Caspase 3 mRNA和蛋白表达的影响 PTL 处理小儿血管瘤内皮细胞24 h 后，检测Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase 3和Caspase 3 mRNA和蛋白表达的变化(图3、4) 。PTL 可促进小儿血管瘤内皮细胞促凋亡蛋白Bax mRNA和蛋白水平表达(均P<0.01)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白水平的表达(均P<0.01)， PTL显著促进Caspase 3 mRNA和Cleaved-Caspase 3蛋白表达上调(均P<0.01)，且促进Cleaved/Total Caspase 3比例上调(P<0.01)，最终致使小儿血管瘤内皮细胞发生凋亡，与对照组相比，其差异均具有统计学意义(均P<0.01)。

注：与对照组相比，*P<0.01图3 20 μmol/L PTL 对小儿血管瘤内皮细胞Bcl-2、Bax、Caspase 3 mRNA表达影响

注：与对照组相比，*P<0.01图4 20 μmol/L PTL 对小儿血管瘤内皮细胞Bcl-2、Bax 和Cleaved-Caspase 3蛋白表达影响

3 讨 论

菊科植物小白菊的胚芽中获得的纯净提取物——小白菊内酯，具有一定的抗癌活性[9]，文献报道，小白菊内酯可以显著抑制人非小细胞性肺癌H1975 细胞凋亡、侵袭与迁移[10]。但小白菊内酯对小儿血管瘤内皮细胞凋亡的影响却少有报道，本研究通过MTS和细胞流式实验筛选出促进小儿血管瘤内皮细胞凋亡的PTL浓度为20、40 μmol/L，后续实验用20 μmol/L PTL干预小儿血管瘤内皮细胞，通过Western blot和实时荧光定量 PCR 检测PTL对小儿血管瘤内皮细胞凋亡相关蛋白表达的影响，Tunel法染色法则可以对单个凋亡细胞进行原位染色，是检测细胞凋亡的特异性和敏感性很高的方法[11],本研究通过Tunel法染色进一步确定PTL对小儿血管瘤内皮细胞的抗凋亡作用。

细胞凋亡是多蛋白相互作用、多基因参与的调控过程，目前研究发现参与调控肿瘤细胞凋亡基因主要有Caspase家族、p53、Bcl-2家族等[12]。肿瘤生长的病理学基础是肿瘤细胞无限制生长，肿瘤细胞无法经历凋亡即程序性死亡，诱导肿瘤细胞凋亡是目前肿瘤研究的关键[13]。Bcl-2和Bax同属于 Bcl-2家族蛋白，具有调控细胞凋亡的功能，Bcl-2具有抗凋亡的功能，Bax具有促凋亡的功能[14-15]，Bax/Bcl-2比值的变化决定细胞凋亡的走向。文献报道，在胶质瘤的治疗中，Bax/Bcl-2的比值可能成为诊断脑胶质瘤的标准[16]。本研究中，PTL显著抑制Bcl-2 mRNA和蛋白的表达，显著促进Bax mRNA和蛋白水平的表达，致使小儿血管瘤内皮细胞Bax/Bcl-2比值明显升高，从而诱发内皮细胞凋亡。

细胞发生凋亡需要特定的酶发挥作用，其中Caspase家族起着关键作用，有文献报道，在TNF-α诱导的细胞凋亡中，会引发一系列的Caspase级联激活，Caspase 8的活化作为反应的第一步[17]，进而激活Caspass 9和Caspass 3,而Caspase 3的激活更是被认为是细胞发生凋亡的早期标志以及细胞凋亡执行因子[18]。文献也报道，Caspase 3上升时，可使恶性肿瘤细胞的异常过度增殖被完全或部分阻断，从而使癌肿瘤病灶停止或延缓生长，因此具有控制甚至是缩小癌肿体积的作用[19]。刘继洪等[20]报道，小白菊内酯能激活Caspase 3表达，诱导结肠癌细胞凋亡，提示Caspase 3是小白菊内酯潜在的药物作用靶点，为将来抗肿瘤应用提供理论基础。本研究中，细胞流式凋亡结果表明，PTL显著促进小儿血管瘤内皮细胞凋亡，Tunel实验结果进一步证实PTL诱导小儿血管瘤内皮细胞凋亡这一结论。

本研究证实PTL可以在体外显著促进小儿血管瘤内皮细胞发生凋亡。该凋亡可能由于PTL下调内皮细胞Bcl-2 表达，上调Bax和Caspase 3表达导致，因此，本研究为PTL用于临床治疗小儿血管瘤提供理论依据。