曾兰花，刘潇潇，陈漫丽，李华，程常勇

(1.广东省药品检验所，广东 广州 510630；2.中山大学新华学院，广东 广州 510600)

薄荷素油(薄荷油) 为唇形科植物薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)的新鲜茎和叶经水蒸气蒸馏、冷冻、部分脱脑加工提取的挥发油，有一种特有的薄荷样香气，香气新鲜、强烈透发，具有消炎镇痛[2]、解痉、抗感染[3]、利胆、溶石排石等作用。现行标准收载于《中国药典》2015年版(一部)，其含量测定采用毛细管气相色谱法[1]，以萘为内标，测定薄荷脑的含量，测定成分单一，难以全面评价薄荷素油的内在质量。本研究采用毛细管气相色谱程序升温法，以环己酮为内标，将薄荷素油中各主要成分分离，测定各组分含量。同时建立薄荷素油指纹图谱，对指纹图谱中主要色谱峰进行归属，以期为进一步完善薄荷素油的质量标准提供参考。

1 材料

1.1 仪器 日本岛津GC-2030气相色谱仪；日本岛津GC-2010AF/FID/ECD气相色谱仪；Thermo Trace1300 FID+ECD+顶空气相色谱仪；空气发生器AG-1602；氢气发生器HG-1803A。色谱柱：HP-INNOWAX(30.0 m×0.25 mm，0.25 μm)；FFAP(30.0 m×0.25 mm，0.25 μm)。

1.2 试剂 环己酮、无水乙醇、萘、联苯、甲醇。

1.3 标准品 薄荷脑(批号：110728-201707，含量为99.8%)、柠檬烯(批号：100470-201302，含量为96.0%)、乙酸薄荷酯(批号：190044-201001，鉴别用)均购于中国食品药品检定研究院；(-)-薄荷酮(批号：M158010-5mL，含量>90.0%)购于阿拉丁试剂公司。内标物环己酮(批号：20190101-1)购于广州化学试剂厂。

1.4 供试品 批号为181216、190118、190219的样品，由黄山天目薄荷药业有限公司提供；批号为OAY180725、OAY181112、OAY190301、OAY190705、OAY191111的样品，由安徽丰乐香料有限责任公司提供。

2 试验方法

2.1 色谱条件 以改性聚乙二醇为固定相的毛细管柱(柱长为30 m，内径为0.25 mm，膜厚度为0.25 μm)，柱温为程序升温：初始温度60 ℃，保持5 min，以每分钟5 ℃的速率升温至125 ℃，保持1 min；再以每分钟2 ℃的速率升温至140 ℃，保持2 min；进样口温度200 ℃；检测器温度250 ℃；分流进样；分流比10∶1。

2.2 溶液制备

2.2.1 内标溶液的制备 取环己酮8 g，用无水乙醇溶解稀释至2 000 mL，作为内标溶液。

2.2.2 对照品储备液的制备 精密称取柠檬烯对照品0.076 74 g、(-)-薄荷酮对照品0.252 68 g、乙酸薄荷酯对照品0.075 86 g、薄荷脑对照品0.405 01 g，至50 mL容量瓶中，用内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(每1 mL含柠檬烯1.473 4 mg、(-)-薄荷酮4.548 2 mg、乙酸薄荷酯1.517 2 mg、薄荷脑8.084 mg)。

2.2.3 混合对照品溶液制备 精密量取对照品储备液4 mL，置10 mL的容量瓶中，加内标溶液稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL含柠檬烯0.589 36 mg、(-)-薄荷酮1.819 30 mg、乙酸薄荷酯0.606 88 mg、薄荷脑3.233 6 mg)。

2.2.4 供试品溶液的制备 称取本品0.2 g，精密称定，至25 mL量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3 测定法 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1 μL，注入气相色谱仪，测定，即得。

3 方法与结果

采用气相色谱法同时测定柠檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷脑4个组分的含量[6-8]。具体试验情况如下：

3.1 准确度试验 取已知含量的同一批号样品(批号：190118，含柠檬烯5.8%；(-)-薄荷酮18.0%；乙酸薄荷酯5.8%；薄荷脑31.4%)0.1 g，按照对照品加入量与所取供试品中相应成分含量为1.5∶1、1∶1、0.5∶1左右，分别按供试品溶液制备方法制备高、中、低3个不同浓度的供试品溶液，各3份，共9份，精密称定，置25 mL容量瓶中，分别加入对照品储备液2、4、6 mL，加内标溶液稀释至刻度，摇匀，制成加样回收供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定,分别计算柠檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷脑的回收率。结果柠檬烯的平均回收率为99.0%，RSD为1.3%(n=9)；(-)-薄荷酮的平均回收率为101.4%，RSD为0.6%(n=9)；乙酸薄荷酯的平均回收率为99.9%，RSD为0.5%(n=9)；薄荷脑的平均回收率为97.0%，RSD为1.5%(n=9)。结果见表1，表明该方法的准确度较好。

表1 准确度(加样回收)试验结果

3.2 重复性试验 精密称取本品(批号：190118)0.2 g，取共6份，按“2.2.4”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，结果：柠檬烯平均含量为6.0%(g·g-1)，RSD为1.5%(n=6)；(-)-薄荷酮平均含量为17.6%(g·g-1)，RSD为1.3%(n=6)；乙酸薄荷酯平均含量为5.9%(g·g-1)，RSD为1.4%(n=6)；薄荷脑平均含量为31.0%(g·g-1)，RSD为1.0%(n=6)。结果表明该方法的重复性良好。

3.3 精密度考察 取“2.2.3”项下制备的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续6次进样，结果柠檬烯峰面积的RSD为0.4%；(-)-薄荷酮峰面积的RSD为0.4%；乙酸薄荷酯峰面积的RSD为0.3%；薄荷脑峰面积的RSD为0.4%。结果表明仪器精密度良好。

3.4 线性关系考察 取“2.2.2”项下的对照品储备液各1、2、4、6、8、10 mL，置10 mL容量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，按“2.1”的色谱条件测定。以进样量(ng)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘图得直线，回归方程如下：

柠檬烯Y=558.4X-10 664(r=0.999 8)；(-)-薄荷酮Y=413.94X-36 306(r=0.999 6)；乙酸薄荷酯Y=444.65X-7 934.1(r=0.999 8)；薄荷脑Y=521.68X-68 500(r=0.999 8)。结果表明：柠檬烯在147.34～1 473.41 ng；(-)-薄荷酮在504.35～5 043.49 ng；乙酸薄荷酯在151.72～1 517.20 ng；薄荷脑在808.40～8 084.00 ng的范围内呈良好的线性关系。

3.5 耐用性

3.5.1 色谱条件考察 经过对恒温和程序升温的多次实验，因为样品主要成分较多，发现程序升温有利于柠檬烯与桉油精、薄荷脑与胡薄荷酮的分离。所以选择了“2.1”作为最终的色谱条件(见图1)。

3.5.2 不同色谱柱及不同色谱仪的考察 取同一份本品溶液(批号：190118)，在不同品牌的聚乙二醇色谱柱上测定以及用同一根气相色谱柱HP-INNOWAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)在不同品牌的气相色谱仪上测定，分离度均良好，测定结果基本一致，结果无明显差别(见表2)。

表2 不同色谱柱及不同色谱仪的考察结果

3.5.3 稳定性考察 精密吸取同一份本品溶液(批号：190118)，分别在第0、5、10、15、20、25 h，注入气相色谱仪中,按“2.1”项下色谱条件进行测定,结果柠檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷脑峰面积的RSD分别为2.0%、1.9%、1.9%、1.8%，结果表明供试品在25 h内稳定性良好。

1.柠檬烯；2.桉油精；3.薄荷酮；4.乙酸薄荷酯；5.薄荷脑；6.胡薄荷酮图1 系统适用性图谱

3.6 样品测定 根据正文制定的方法，按含量测定方法测定，测定了8批薄荷素油里柠檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷脑的含量，结果详见表3。

表3 样品含量测定结果

4 指纹图谱

按现行标准进行检验，桉油精峰峰面积小，不适合作为参照峰。以柠檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷脑为参照峰，建立指纹图谱，并进行方法学考察，以期为其质量控制提供参考[4-5]。

4.1 重复性试验 取同一批样品(批号：190118)，约0.2 g，精密称定，共6份，按 “2.2.4”项下的方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定。以薄荷脑为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果测得各共有色谱峰的相对保留时间没有显著性差异，RSD为0；共有峰的相对峰面积RSD均<3%；采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件进行处理,6份样品的图谱与对照图谱相似度≥0.999，结果表明方法的重复性良好。

4.2 稳定性试验 取同一批样品(批号：190118)，约0.2 g，精密称定，按含量测定“2.2.4”项下的方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，分别于0、5、10、15、20、25 h注入气相色谱仪进行分析，记录色谱图。以环己酮为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果测得各共有色谱峰的相对保留时间RSD<0.1%，共有峰的相对峰面积RSD<5.0%；采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件进行处理，6次进样的图谱与对照图谱相似度均≥0.998，结果表明供试品溶液在25 h内稳定。

4.3 不同色谱柱 试验中考察了2种不同型号的色谱柱：S1:Agilent HP-INNOWAX毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，S2:Agela Technologies DA-FFAP毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。结果采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件进行处理，2份进样的图谱与对照图谱相似度均≥0.998，结果表明供试品溶液在不同型号色谱柱中稳定。

4.4 不同仪器 试验中考察了3种不同品牌型号的气相色谱仪：S1:Shimadzu GC-2030 气相色谱仪；S2:Shimadzu GC-2010 气相色谱仪；S3：Thermo Scientific Trace 1300气相色谱仪。结果采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件进行处理，3份进样的图谱与对照图谱相似度均≥0.994，结果表明供试品溶液在不同品牌型号的气相色谱仪中稳定。

4.5 样品测定及色谱峰的化学成分指认 取8批薄荷素油样品，按照含量测定“2.2.4”项下制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。对所有样品的色谱图进行统一积分后，将所得图谱以AIA格式导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”软件进行处理， 8批AIA格式的色谱图生成对照图谱；选择平均数法作为对照图谱的生成方法，时间窗宽度设为0.1，运用多点校正方法对色谱峰进行Mark峰匹配，得到8批样品 GC 指纹图谱叠加图，确定了6个共有峰，通过与对照品比对，指认峰1、2、4、6分别为柠檬烯、(-)-薄荷酮、乙酸薄荷酯、薄荷脑。混合对照品溶液、供试品溶液色谱图分别见图2～3。

1.柠檬烯；2.(-)-薄荷酮；4.乙酸薄荷酯；S.薄荷脑图2 混合对照品溶液色谱图

1.柠檬烯；2.(-)-薄荷酮；4.乙酸薄荷酯；S.薄荷脑图3 供试品溶液色谱图

4.6 指纹图谱的建立及相似度评价

4.6.1 指纹图谱共有模式的建立 将所得8批薄荷素油GC图谱以AIA格式依次导入国家药典委员会研制的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)软件，确定了除溶剂峰与内标峰以外的6个共有峰，建立了薄荷素油GC 指纹图谱。

4.6.2 样品检验结果与分析 8批薄荷素油GC指纹图谱叠加图(见图4)，生成对照指纹图谱，并进行了相似度计算，结果除溶剂峰和内标峰以外，8批供试品的相似度范围：0.997～0.999；样品之间的相似度较高，均大于0.90，故8批样品均符合规定(见表4)。

图4 8批薄荷素油GC指纹图谱叠加图

表4 8批供试品相似度评价结果

5 讨论

本文考察了多种物质作为内标物，其中萘与联苯色谱峰保留时间远大于共有峰保留时间，而环己酮色谱峰在柠檬烯与(-)-薄荷酮之间，且与样品中的其他色谱峰均能得到很好的分离，故选择环己酮作为本实验的内标物。完善了薄荷素油现行质量标准。采用多参照峰指纹图谱结合多组分含量测定的质量评价模式，能更全面地对薄荷素油进行质量控制。

本试验以薄荷素油《中国药典》2015年版标准为基础，修订了气相指纹图谱，标定共有峰6个，指认了其中4 个化学成分，并对4个成分进行了定量检测。多组分含量测定与指纹图谱结合，较常规检验和单个成分定量测定，更能全面反映该制剂质量的一致性和稳定性，对薄荷素油的质量评价有更积极的意义，为保证临床用药的安全性、有效性和稳定性提供了方法和依据。