骆晓凤，朱叶飞，赵水娣，胡慧敏，徐新艳

南京医科大学第二附属医院检验医学中心,江苏南京 210011

流感嗜血杆菌是最常见的一种导致儿童社区获得性肺炎和中耳炎的病原体[1]，还可引起小儿浸润性疾病，如脑膜炎和败血症[2]。随着抗菌药物在全球范围内广泛使用，在许多国家和地区，流感嗜血杆菌对氨苄西林及其他常用抗菌药物的耐药率越来越高[3]，其耐药机制主要是由于β-内酰胺酶的产生或是青霉素结合位点(PBPs)对β-内酰胺类抗菌药物的亲和力下降[4]。目前第三、四代头孢菌素及碳青霉烯类药物已经成为治疗耐氨苄西林流感嗜血杆菌感染的首选。为了解不同感染部位来源流感嗜血杆菌菌株的流行病学特征和药敏情况，本研究对2016—2019年非呼吸道和呼吸道检出的流感嗜血杆菌进行回顾性分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2016—2019年分离的流感嗜血杆菌，剔除同一患者相同部位的重复菌株，共分离284株，感染患者中男171例、女113例。将呼吸道来源的流感嗜血杆菌患者按年龄划分为A、B、C、D、E 5组，其中A组为0～3岁(婴幼儿)，B组为>3～14岁(儿童)、C组为>14～18岁(青少年)，D组为>18～59岁(成年人)，E组为>59岁(老年人)。流感嗜血杆菌ATCC49247质控菌株购于江苏英科新创医学科技有限公司。

1.2仪器与试剂 法国生物梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏仪及其配套的NH鉴定卡(奈瑟菌、嗜血杆菌鉴定卡)，CO2培养箱为美国赛默飞世尔科技(阿什威尔)有限公司Forma3111。血琼脂平板、巧克力平板、M-H平板、HTM平板均购于上海科玛嘉微生物技术有限公司，Kirby-Bauer法药敏纸片和β-内酰胺酶由OXOID公司提供，所有试剂均在有效期内使用。

1.3方法

1.3.1分离与鉴定 按照《全国临床检验操作规程》(第4版)要求，选用含V因子和X因子的巧克力培养基进行分离培养，将其置于5%CO2、35 ℃孵箱内培养18～24 h。采用法国生物梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定药敏仪及NH鉴定卡进行细菌鉴定。

1.3.2β-内酰胺酶敏感性和药敏试验 采用头孢硝噻吩纸片法检测β-内酰胺酶的敏感性，采用Kirby-Bauer法进行药敏试验。判断标准参照2019年美国临床实验室标准化协会(CLSI)相关文件。

1.4统计学处理 采用WHONET5.6软件分析药敏试验结果，采用Graph Pad Prism 8.0.1统计软件处理数据，计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1流感嗜血杆菌的分布特征 分离的284株流感嗜血杆菌中包括呼吸道来源270株[其中痰液(属于下呼吸道标本)259株、咽拭子9株、肺泡灌洗液2株]，占95.07%，非呼吸道来源14株(其中眼拭子10株、分泌物2株、脓液1株和静脉导管1株)，占4.93%。2016—2019年下呼吸道(痰液)标本检出流感嗜血杆菌共259株，检出率为0.31%，且4年间检出率存在一定的波动，2016—2019年检出率分别为0.43%、0.19%、0.28%、0.35%。因非呼吸道和上呼吸道(咽拭子)标本检出例数较少，不进行统计分析。

2.2呼吸道来源的流感嗜血杆菌流行病学特征 270例呼吸道来源的流感嗜血杆菌感染患者分布存在季节性差异，呈冬、春两季高发性，1—5月共分离流感嗜血杆菌178株，占65.93%，感染高峰集中在2—5月(156株，57.78%)。

不同年龄患者呼吸道来源的流感嗜血杆菌构成比不同：婴幼儿(172例，63.70%)易感性明显高于儿童(35例，12.96%)、青少年(1例，0.37%)、成年人(16例，5.93%)和老年人(46例，17.04%)，差异均有统计学意义(P<0.05)；老年人较青少年和成年人易感，差异有统计学意义(P<0.05)；儿童及成年人易感性均明显高于青少年，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3流感嗜血杆菌β-内酰胺酶检测情况和耐药性分析 2017—2019年下呼吸道(痰液)来源流感嗜血杆菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、阿奇霉素的耐药率较2016年有上升趋势。见表1。

表1 2016—2019年259株下呼吸道(痰液)来源流感嗜血杆菌的耐药率(%)

续表1 2016—2019年259株下呼吸道(痰液)来源流感嗜血杆菌的耐药率(%)

呼吸道检出β-内酰胺酶阳性且对氨苄西林耐药的流感嗜血杆菌147株，占54.44%(147/270)。检出β-内酰胺酶阴性且对氨苄西林耐药的流感嗜血杆菌34株，占12.60%，氨苄西林总耐药率为67.04%；检出β-内酰胺酶阴性且对氨苄西林敏感的流感嗜血杆菌89株，占32.96%，β-内酰胺酶阳性且对氨苄西林敏感的流感嗜血杆菌0株。β-内酰胺酶阳性流感嗜血杆菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿奇霉素、头孢呋辛钠及复方磺胺甲噁唑的耐药率均明显高于β-内酰胺酶阴性菌株(P<0.05)。非呼吸道分离的14株流感嗜血杆菌中β-内酰胺酶阳性且对氨苄西林耐药2株，β-内酰胺酶阴性且对氨苄西林耐药2株，β-内酰胺酶阴性且对氨苄西林敏感10株。见表2。

2.4不同年龄段患者呼吸道来源流感嗜血杆菌耐药情况分析 按年龄将270例流感嗜血杆菌感染患者分为A～E 5个组，因C组仅1例，且对表3中各种抗菌药物均敏感，故不列入表3进行分析。婴幼儿对氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛钠的敏感性均明显高于儿童和成年人(P<0.05)，且老年人对阿奇霉素较婴幼儿敏感(P<0.05)，儿童对氨苄西林的耐药率明显高于成年人(P<0.05)。见表3。

表2 呼吸道来源的β-内酰胺酶阳性和β-内酰胺酶阴性流感嗜血杆菌的耐药情况(n)

表3 不同年龄段患者呼吸道来源流感嗜血杆菌对常用抗菌药物的耐药率分析[n(%)]

2.5不同感染部位流感嗜血杆菌的耐药情况分析 呼吸道分离的流感嗜血杆菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛钠的耐药率高于非呼吸道菌株(P<0.05)。非呼吸道标本仅有14株，结果代表性不强。见表4。

表4 呼吸道标本与非呼吸道标本流感嗜血杆菌耐药率分析[n(%)]

续表4 呼吸道标本与非呼吸道标本流感嗜血杆菌耐药率分析[n(%)]

3 讨 论

流感嗜血杆菌已经成为呼吸道感染的重要致病菌之一。本院下呼吸道(痰液)标本流感嗜血杆菌的检出率为0.31%，低于2016年中国细菌耐药性监测网(CHINET)结果(2.76%)[5]，可能的原因：(1)本文仅统计了1所医院的住院患者；(2)患者早期经验性地使用抗菌药物；(3)流感嗜血杆菌对生长环境和营养条件要求高，不易分离。

本研究结果与2016年的一项多中心研究结果相近[6]，感染呈季节性分布，春、冬两季高发。另有研究显示，3岁以下婴幼儿的免疫系统发育未健全，缺乏对流感嗜血杆菌的抑菌活力，因此该年龄段流感嗜血杆菌感染率高[7]。本研究284例流感嗜血杆菌感染患者中，婴幼儿易感性明显高于其他各年龄段人群(P<0.05)，支持了以上观点。

氨苄西林是抗流感嗜血杆菌感染的首选药物。流感嗜血杆菌对氨苄西林等β-内酰胺类抗菌药物的耐药机制主要是产β-内酰胺酶，可水解抗菌药物的β-内酰胺环，从而使抗菌药物失活[8-9]。2016年CHINET数据显示，国内流感嗜血杆菌儿童株和成人株的产酶率分别为28.3%和29.9%[5]。本研究270例呼吸道流感嗜血杆菌感染患者，分离出β-内酰胺酶阳性且对氨苄西林耐药菌株为147株，产酶率为54.44%，结果提示，产β-内酰胺酶是流感嗜血杆菌的主要耐药机制。本院流感嗜血杆菌产酶率高于2016年CHINET数据可能原因：(1)随着时间的推移，患者抗菌药物的暴露增加；(2)标本量不足够大，仅反映本院数据。β-内酰胺酶阴性且对氨苄西林耐药的机制主要是由青霉素结合蛋白(PBP)改变引起的，使PBP对β-内酰胺类药物的亲和力减弱，导致耐药性的出现[10]。本研究有34株呼吸道来源β-内酰胺酶阴性且对氨苄西林耐药的菌株，占12.59%，略高于2016年我国的一项多中心研究结果(9.3%)[6]。

流感嗜血杆菌还会引起尿道和生殖道感染。有研究显示，呼吸道分泌物中的流感嗜血杆菌对氨苄西林、头孢呋辛、克拉霉素和复方磺胺甲噁唑的耐药率明显高于阴道分泌物[9]。本院调查结果显示，呼吸道来源的流感嗜血杆菌对大多数常用抗菌药物的耐药率均高于非呼吸道，即不同感染部位流感嗜血杆菌对抗菌药物的敏感性不同。总体而言，针对流感嗜血杆菌治疗的最佳抗菌药物可能因感染部位不同而有所区别。

本研究存在的不足：非呼吸道分离的流感嗜血杆菌仅有14株，样本量太小，代表性不强，但总体上还是可以反映本院非呼吸道标本流感嗜血杆菌感染对各类抗菌药物的耐药情况。治疗流感嗜血杆菌的敏感抗菌药物可能因感染部位而异，临床医师应根据感染部位选择性用药。本研究致力于掌握流感嗜血杆菌的分布特征及不同感染部位来源流感嗜血杆菌的耐药特点，进而指导临床合理使用抗菌药物、控制耐药菌株的传播。