孙彦琳，程璧瑄，周利君，罗 昱，王 婧，万会花，于 超

（花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室/国家花卉工程技术研究中心/城乡生态环境北京实验室/园林环境教育部工程研究中心/林木花卉遗传育种教育部重点实验室/北京林业大学园林学院，北京 100083）

现代月季（Rosa spp.）是蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（Rosa L.）重要的观赏植物类群。是由中国古老月季与欧洲的蔷薇属植物经过反复杂交，于1867年之后育成的一个庞大的品种群。现代月季具有花型饱满、花期长、花色丰富、花香迷人等优点，具有极高的经济价值和文化价值，是世界重要的观赏植物[1]。

花色是观赏植物最重要的观赏性状之一。对于花色表型的研究，传统的研究方法是采用RHSCC（royal horticultural society color chart）或 ISCC-NBS色名表示法[2]。随着现代科技的发展，仪器测色方法逐渐普及，依靠数字化技术实现色彩的数量化，使对颜色的描述转变为客观的定量描述，更加精准也便于交流，扩大了新品种选育和植物置景应用的前景[3-4]。

木本植物童期较长，通常需等到月季开花后才能对其花色进行分辨，使得现代月季的育种周期延长。前人通过观察发现，月季嫩芽、嫩叶颜色较深的品种其花色往往也呈现出较深的颜色[5-6]，这说明月季新叶叶色与花色存在一定的相关性。然而前人研究仅停留在目视测色和对花色进行定性分析的水平，并没有量化数据的支撑。此外，有学者对月季花瓣中花色素种类及其与花色的关系进行了详尽的研究[7-10]，但对月季新叶色素与花色关系的研究尚未有报道。

本研究测量了月季新叶的SPAD值、花青苷含量，并采用CIELab系统对新叶和花的颜色进行定量描述。探究月季新叶叶色与花色的相关性，从月季早春嫩叶颜色推测开花花色，在一定程度上解决育种中存在的育种周期长、育种效率低等问题，也可为观赏植物的早期选择研究提供思路。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究以“云蒸霞蔚”（Rosa' Yunzheng Xiawei'）ד太阳城”（R.'Sun City'）的183株F1代群体为试验材料，材料均种植于北京林业大学小汤山实验基地。所有植株生长环境相同、长势一致。“云蒸霞蔚”为古老月季品种，“太阳城”为现代月季品种，遗传背景复杂。二者表型及抗性均有较大区别，遗传距离远，其子代花色变异丰富，本试验研究对象F1代群体花色包括了白、粉、红、橙和黄5个色系，不同色系植株新叶色间存在差异，有黄绿色、绿色、红色和紫红色等，是开展花色与叶色研究的良好材料。

1.2 试验数据测量

取供试植株健康新鲜、色泽均匀、无病菌无损伤、完全展开、叶色达到较稳定阶段的成熟新叶（月季新叶叶片从折叠到完全展开的48 h内），部位为植株地上部分15～20 cm之间，测定SPAD值和色彩参数，叶片处理后进行花青苷含量测定，并于盛花期测量花色数据。

1.2.1 SPAD值测定

使用TYS-A叶绿素仪对植株叶片SPAD值进行直接测定。先将叶片擦拭干净，选取叶片的几何中心、叶脉两侧且占比较大的颜色区域进行测量，每个植株测量3片新叶，每个叶片测量3次，计算平均值。

1.2.2 花青苷含量测定

每株取15～20片新叶，除去叶柄，用锡箔纸包裹后编号，迅速置于液氮中，后放入-80℃低温冰箱保存，于次日进行花青苷含量的测定。将叶片充分研磨，用配置比例为甲醇∶水∶甲酸∶三氟乙酸=70∶27∶2∶1的浸提剂浸提样品粉末里的花青苷，用超声波清洗器超声波震荡辅助浸提并离心得到上清液，使用紫外可见光光度计（BioMate 3S）测定花青苷含量[11]。

1.2.3 叶片色差值测定

采用国际照明委员会推出的CIELab表色系统，用明度L*、色相a*、色相b*、色角度h及饱和度C等变量表示色彩。其中L*值反映颜色的明亮程度，0表示黑色，100表示白色。a*值反映红色或绿色物质的浓度，a*＞0表示颜色偏红，a*＜0表示颜色偏绿。b*值反映橙色或蓝色物质的浓度，b*＞0表示颜色偏橙，b*＜0表示颜色偏蓝。

对色差仪（NF333）进行黑白校准后，直接测量色彩参数L*、a*、b*值，每个植株测量3片新叶，计算平均值。之后根据a*、b*计算色彩属性指标饱和度C∶C=（a*2+b*2）1/2，色度角h∶h=tan-1（b*/a*）。

1.2.4 花瓣色差值测定

每株采集盛花期（花被与花药完全展开的时期）的新鲜花瓣3～5片，使用色差仪对花瓣颜色进行测定，测定位置选取每片花瓣十字交叉的中心，取平均值代表单个植株的花瓣色差值。

1.3 数据分析

试验使用Excel 2016对数据进行整合与筛选，制表并且进行显著性水平方差分析。使用SPSS 25软件对月季新叶参数和花色参数进行相关性分析并计算回归方程。

2 结果与分析

2.1 F1代植株新叶SPAD值、花青苷含量与色彩表型分布

F1代植株新叶SPAD值范围为7.5～38.6，花青苷相对含量的范围为0.14～3.37 μg/mg，新叶叶色随着a*值从负值到正值的增大呈绿色-黄绿-红色-紫红色的变化。由图1可知，a*值与新叶L*值、b*值呈显著负相关关系，a*与b*的线性回归方程为y=-0.703 5x+17.452（R2=0.63），a*与 L*的线性回归方程为 y=-0.502 8x+34.186（R2=0.63）。

图1 作图群体叶色表型分布Figure 1 Leaf color distribution of the segregating population

2.2 F1代植株花色表型分布

本试验采用于超[12]的分类方法，将F1代植株分为5个色系：红色系、粉色系、橙色系、黄色系、白色系。根据CIELab空间表色系统对F1代的花瓣进行测定，5个色系的参数值的分布范围如表1所示。

表1 F1代各色系花色CIELab参数统计分析Table 1 Statistical analysis on CIELab parameters of different petal color groups in F1population

利用箱线图（图2）对各色系的CIELab颜色系统参数进行分析发现，各色系L*、a*、b*值分布特征有一定的规律，可以将5个色系分开。黄色系、白色系L*值较大且分布集中，a*值低且有负值分布；白色系b*值偏低，但黄色系b*值分布较广泛；红色系的L*值小于其他色系，而a*值明显高于其他色系；粉色系的L*值与a*值分布范围相对宽泛，但是b*值明显偏小；橙色系3个参数分布都较广泛。

图2 作图群体各色系L*、a*、b*值箱线图Figure 2 The box plot of different color groups of the segregating population according to L*，a*，b*

作图群体在a*、b*色相坐标系中的分布如图3A所示，5个色系呈分散分布但色系内明显聚集，主要集中分布在第Ⅰ象限，部分黄色、白色系分布在第Ⅱ象限，而代表蓝色、紫色的第Ⅲ、Ⅳ象限没有分布。通过 L*、a*值散点图（图 3C）可以看出，L*与 a*呈负相关，拟合的线性回归方程为y=-0.53x+86.494（R2=0.95）。L*、a*、b*值三维坐标图（图 3B）可以更加直观地展示各个花色的分布规律，总体上各色系呈三维带状分布，粉色、红色系分布距离更接近a*轴和L*轴下部，颜色越黄距离b*轴越近。

不同色系的明度L*与饱和度C之间的关系不同，根据被测植株的L*值和C值在二维坐标的分布，可将其分为两个类群（图3D）。第一类群包括白色和黄色系，L*值随C值的增大而减小，斜率较小，散点分布几乎平行于x轴（图4A）；第二类群包括粉色、红色和橙色系，L*值随C值增大显著减小，斜率较大（图4B）。第一类群L*值与C值线性回归拟合水平并不显著（R2=0.20），第二类群的L*值与C值之间线性回归拟合水平较显著（R2=0.76），拟合函数为y=-0.541 4x+93.298。

图3 作图群体花色表型分布图Figure 3 Flower color distribution of the segregating population

图4 作图群体L*值与C值关系Figure 4 Relationships between L*and C among segregating population

2.3 新叶SPAD值、花青苷含量、色差值与花瓣色差值相关性分析

在对F1代植株各色系新叶花青苷含量、SPAD值、色差值统计分析（表2）中得出，红色系新叶花青苷平均含量最高，新叶L*均值较小、a*均值最大、C均值最小，说明其新叶色较红、较暗、饱和度较低。而白色、黄色系花的参数值表现出相反的特征，新叶花青苷平均含量低、新叶亮度高，叶色偏绿、饱和度较高。粉色系与橙色系的花青苷含量和新叶L*、a*均值居于红色和白黄色系之间。

表2 F1代植株各色系新叶花青苷含量、SPAD值、色差值统计分析Table 2 Statistical analysis on SPAD value,anthocyanin content and CIELab parameters of different color groups in F1population

花瓣L*、a*、C值、新叶花青苷含量与新叶5个色差参数间都呈现极显著相关（表3）。花瓣L*和a*与新叶花青苷含量的相关性最强，相关系数分别为-0.400和0.439，回归方程分别为：y=-5.527 4x+80.829（R2=0.16）、y=11.091x+9.827 1（R2=0.19）。此外花瓣饱和度C与新叶花青苷含量也呈极显著正相关；在叶色色差与花色色差值的相关性中，新叶L*值和花瓣L*值、新叶a*值和花瓣a*值之间均呈极显著正相关，新叶a*值与花瓣L*值、新叶L*值与花瓣a*值、新叶C值和花瓣C值呈极显著负相关。说明叶色越亮则花色越亮，叶色越红则花色越红，叶色越红花色越暗，叶色越暗花色越红。花瓣色差值与SPAD值的相关性较弱，仅与花色b*、h间存在正相关和负相关关系。

表3 F1代植株新叶SPAD值、新叶花青苷含量、色差值与花瓣色差值之间的相关系数Table 3 Correlation coefficient between new leaf SPAD value,anthocyanin content,chromatic aberration and flower chromatic aberration in F1population

3 讨论与结论

花色是月季重要的观赏性状，“云蒸霞蔚”ד太阳城”的F1代5个花色色系的植株在a*和b*二维象限图中主要分布在第Ⅰ象限，部分白色和黄色系资源分布在第Ⅱ象限，而在代表紫色、蓝色的Ⅲ和Ⅳ象限没有分布。这是由于在月季资源中缺少合成飞燕草素苷的关键酶—F3’5’H，导致月季代谢途径中只存在形成红色的天竺葵素苷和矢车菊素苷两条代谢通路，使整个月季资源中没有真正的蓝色花[13]。因此在月季花色的改良育种工作中，进一步丰富月季中花青素苷合成途径的基因资源，建立飞燕草素苷生物合成途径，对培育蓝色月季具有重要意义。

在现代月季的研究、选育与生产工作中，研究者通常需等到月季开花后才能对其花色进行分辨，使得现代月季的育种周期延长，因此开展早期预选研究对缩短育种周期有重要意义。在植物发育中，不同器官之间存在相关性，林木早期选择就是是利用幼年与后期性状的相关性，对生长作出预测，从而缩短育种评定时间,提高选择效率[14-15]。国内外学者对多个树种开展了早期选择研究,取得了重大进展[16-18]。在观赏植物中也有对早期选择的研究。孙凡雅等研究发现，观赏海棠父本木质部与其花瓣花色苷含量的存在显著相关性，可以利用木质部花色苷含量可以对杂交后代的花色、果色进行预选[19]。本实验通过探讨月季新叶花青苷含量、SPAD值、色差值与花色的相关性，能够通过月季早春新叶推测花色，能够在一定程度上对月季进行早期选择。

图5 作图群体新叶花青苷含量与花瓣L*值、a*值关系Figure 5 Relationships between new leaf anthocyanin content with petal L*and a*among segregating population

程怡等[8]研究粉色月季品种‘仙境’发现花青苷对花色形成起直接作用，本实验中新叶花青苷含量与花瓣L*和a*的关系是所有叶色参数与花色参数中关联性最强的。在对新叶花青苷含量与花色的相关性分析中得出，花青苷含量与花瓣L*值呈显著负相关，与a*和C呈显著正相关，说明新叶花青苷含量越高，花色越红、越暗、色彩饱和度越低；花青苷含量低，花色偏黄色和白色。在月季叶色和花色的相关性研究中，唐仕荣[5]发现月季嫩枝茎叶的颜色与开花花色存在一定的对应规律，如嫩枝茎叶为红色，其花色多为红色，且红的程度决定花朵红色的程度。王升等[6]对月季花色与幼嫩芽、叶的相关性进行分析也发现，月季嫩芽、嫩叶颜色较深的品种花色往往较深。本试验通CIELab系统对花色与叶色进行量化描述，进一步验证了前人的结论。试验得出，新叶L*值和花瓣L*值、新叶a*值和花瓣a*值之间均呈显著正相关，新叶a*值与花瓣L*值、新叶L*值与花瓣a*值以及新叶C与花色C值间呈显著负相关。

综上所述，新叶花青苷含量越低、L*值（亮度）越大（亮）、a*值越小（新叶色越绿）、C均值越大（色彩饱和度高）则花色L*值（亮度）越大（亮）、a*值越小，花色偏白色和黄色系。反之，花色偏红色系和橙色系。