曾凯，王欣冉，杜雪

(哈尔滨医科大学附属第一医院重症医学科，黑龙江 哈尔滨 150000)

巨噬细胞是重要的天然免疫细胞，可以发生不同水平的活化状态，形成不同的极化类型，即 M1 型极化(介导促炎和杀伤)和 M2 型极化(介导抑炎和修复)，且巨噬细胞极化是其发挥免疫稳态调控功能的重要形式[1-2]。由于巨噬细胞在微环境稳态调控中发挥重要的作用，若巨噬细胞的极化失衡，可导致微环境内免疫稳态平衡被破坏，引发多种免疫相关性疾病[3-4]。因此，寻找巨噬细胞极化的调控靶点，深入探讨其调控机制，对于靶向巨噬细胞的免疫干预意义重大。Hippo通路是细胞增殖、存活、分化和维持组织稳态的有效调节通路[5-6]，而YAP既是Hippo信号通路中的关键蛋白，也是一种重要的免疫调控分子[7]。目前，尚无有关YAP对巨噬细胞极化的作用和机制详细报道，本研究旨在探讨Hippo信号通路关键蛋白YAP调控巨噬细胞极化的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人单核细胞系THP-1细胞购于ATCC，RPMI 1640培养基购自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清购自天津康源生物技术有限公司；佛波酯(PMA)、脂多糖(LPS)、白细胞介素-4(IL-4)购自美国Sigma公司；FITC-CD86、PE-CD206抗体购自美国BD公司；YAP表达质粒、包含无序基因片段的对照质粒及YAP、IL-1β、CCL22、β-actin的引物由大连宝生物有限公司合成；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；TRIzol试剂、逆转录试剂盒、PCR Master Mix试剂盒购自大连大连宝生物有限公司；TNF-α和TGF-β酶联免疫吸附试剂盒购自美国eBiosicence公司；兔抗人YAP抗体、兔抗人IL-1β抗体、兔抗人CCL22抗体、兔抗人GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 THP-1细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，培养条件为37 ℃、5% CO2饱和湿度，待细胞处于80%融合时进行传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 M1型和M2型巨噬细胞诱导 将处于对数生长期的THP-1细胞在含200 ng/mL佛波酯(PMA)、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养48 h贴壁后，弃去培养液，1×PBS洗涤3次，诱导成为M0巨噬细胞作为对照组，然后将细胞继续在含500 ng/mL脂多糖(LPS)、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养24 h，诱导为M1型巨噬细胞，在含20 ng/mL 白细胞介素-4(IL-4)、10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养24 h，诱导为M2型巨噬细胞。

1.2.3 细胞转染 取对数生长期的M1型巨噬细胞接种于6孔板，严格按照Lipofectamine 2000转染试剂盒操作说明书将慢病毒包装的YAP表达质粒(YAP表达质粒组，上游引物序列:5’-CCTGCGTAGCCAGTTACCAA-3’、下游引物序列:5’-CCATCTCATCCACACTGTTC-3’)、慢病毒包装的无序对照质粒(对照质粒组，上游引物序列:5’-CACCAAGCGAGGACTGAGCAT-3’、下游引物序列:5’-GCCAGACCCAGAAGGAGAAGC-3’)及慢病毒空载体(空载体组)转染至靶细胞，48 h后，应用实时定量PCR法检测转染细胞中YAP表达水平，收集细胞进行后续实验。

1.2.4 流式细胞术检测 M1型和M2型巨噬细胞标志物水平 收集诱导的各组细胞，细胞密度为5×105个/mL，每管加入500 μL细胞悬液，分别加入FITC-CD86、PE-CD206抗体和同型对照抗体，经室温避光孵育30 min 后，洗涤、弃上清，加入500 μL磷酸盐缓冲液上机检测。

1.2.5 酶联免疫吸附法检测 M1型和M2型巨噬细胞特异性分泌因子水平 收集诱导的各组细胞培养上清液，严格按照TNF-α和TGF-β酶联免疫吸附试剂盒说明书进行操作，采用THERMO公司的BIOTEK酶标仪在450 nm处检测吸光度值，根据标准曲线(y=0.824-0.762x，r2=0.967)，计算各组上清液中TNF-α和TGF-β水平。

1.2.6 实时定量PCR检测mRNA表达水平 收集各组细胞，采用TRIzol法提取细胞总mRNA，按照逆转录试剂盒操作说明书进行逆转录反应合成cDNA，产物4 ℃保存备用。使用7500型实施定量PCR检测仪进行实时PCR扩增反应，YAP mRNA上游引物序列：5’-CCTGCGTAGCCAGTTACCAA-3’、下游引物序列：5’-CCATCTCATCCACACTGTTC-3’；CCL22 mRNA上游引物序列5’AGGATGCGTGACTT

TGTG3’、下游引物序列:5’GTATCTACTATTGCGAGG

TG3’；IL-1β mRNA上游引物序列：5’-GACACATGGGATAACGAGGC-3’、下游引物序列：5’-ACGCAGGACAGGTACAGATT-3’；β-actin mRNA上游引物序列：5’-TACAACTCCTTGCAGCTCC-3’、下游引物序列：5’-ATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3’，以β-actin作为内参基因，最后采用2-△△CT方法计算目的基因mRNA表达水平。

1.2.7 Western blot检测蛋白表达 收集各组细胞，经超声破碎后，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，进行SDS-PAGE电泳，并湿转至硝酸纤维素膜上，奶粉封闭2 h，加入已稀释的一抗( 兔抗人YAP 抗体1∶500、兔抗人CCL22抗体1∶1 000、兔抗人IL-1β抗体1∶1 000、兔抗人β-actin抗体抗体1∶8 000)，4 ℃过夜；次日，经洗涤后，加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG1∶40 000)，室温孵育2 h；经TBS-T洗涤后，使用化学发光底物试剂检测目的蛋白，并曝光X线胶片，使用mage J软件对蛋白条带进行灰度分析，以GAPDH为内参蛋白。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 M1型和M2型巨噬细胞诱导结果

流式细胞术检测结果显示，M1型巨噬细胞组CD86+细胞比例[(47.89±6.32)%]及M2型巨噬细胞组CD206+细胞比例[(70.2±78.93)%]高于对照组[(3.09±0.28)%，(6.56±0.43)%]，差异均有统计学意义(P<0.05)；酶联免疫吸附法检测结果显示，M1型巨噬细胞组培养上清液中TNF-α水平高于对照组和M2型巨噬细胞组，M2型巨噬细胞组培养上清液中TGF-β水平高于对照组和M1型巨噬细胞组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示M1型和M2型巨噬细胞诱导成功。见图1-图3。

2.2 YAP在M1型和M2型巨噬细胞中的表达比较

实时定量PCR检测结果显示，YAP在M1型巨噬细胞中的表达水平低于M2型巨噬细胞(P<0.05)，见图4；Western blot检测结果显示，YAP在M1型巨噬细胞中的表达水平低于M2型巨噬细胞(P<0.05)，提示YAP可能与M2型巨噬细胞的表型维持有关。见图5。

2.3 YAP抑制M1表型形成和促进M2表型形成比较

流式细胞术检测结果显示，空载体组、对照质粒组、YAP表达质粒组CD86+细胞比例分别为(46.5±17.03)%、(45.5±85.92)%、(26.4±78.02)%，空载体组、对照质粒组、YAP表达质粒组CD206+细胞比例分别为(13.27±2.46)%、(14.0±21.87)%、(53.62±10.35)%，YAP表达质粒组CD86+细胞比例低于空载体组和对照质粒组，而CD206+细胞比例高于空载体组和对照质粒组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，图6；实时定量PCR检测结果显示，与对照质粒组相比，YAP表达质粒组中，M1型巨噬细胞标志物IL-1β mRNA表达水平降低(P<0.05)，M2型巨噬细胞标志物CCL22 mRNA表达水平升高(P<0.05)，图7；Western blot检测结果显示，与对照质粒组相比，YAP表达质粒组中，M1型巨噬细胞标志物IL-1β 蛋白表达水平降低(P<0.05)，M2型巨噬细胞标志物CCL22蛋白表达水平升高(P<0.05)，提示YAP可能抑制M1型巨噬细胞的形成和促进M2表型形成，图8。

3 讨论

巨噬细胞是一种具有较强可塑性和功能异质性的免疫细胞，其可在不同刺激因素的作用下，分化成不同表型进而发挥不同的生物学作用[8]。研究[9-10]显示，在干扰素或脂多糖的刺激下，巨噬细胞可向M1型方向极化，而在白介素4或白介素3的刺激下，巨噬细胞可向M2型方向极化。M1型巨噬细胞具有杀伤病原体和抗肿瘤免疫反应的作用[11]，而M2型巨噬细胞具有抑制免疫应答的能力[12]。巨噬细胞极化是巨噬细胞发挥免疫稳态调控功能的重要形式，若极化失衡，则可引起免疫稳态紊乱，导致疾病发生[13-14]。因此，寻找巨噬细胞极化的调控靶点，深入探讨其调控机制，对于靶向巨噬细胞的免疫干预意义重大。

Hippo通路是细胞增殖、存活、分化和维持组织稳态的有效调节通路[15-16]。研究[17]显示，YAP是Hippo信号通路的关键蛋白，其可作为转录共激活分子促进肿瘤细胞的增殖。另有研究[18]发现，YAP 还可诱导趋化因子2的表达，协助肿瘤细胞发生免疫逃逸。最近还有研究[19]发现，YAP 能促进肿瘤细胞释放炎症因子，同时招募肿瘤相关巨噬细胞。然而，目前有关YAP对巨噬细胞极化的作用和机制的研究极少。

本研究首先通过PMA诱导THP-1细胞成为巨噬细胞，再经脂多糖诱导为M1型巨噬细胞，经白介素-4诱导为M2型巨噬细胞，并通过流式细胞术检测了M1型巨噬细胞标志物CD86+M2型巨噬细胞标志物CD206的表达，通过酶联免疫吸附法检测M1型巨噬细胞特异性分泌因子TNF-α和M2型巨噬细胞特异性分泌因子TGF-β水平，结果提示M1型和M2型巨噬细胞模型建立成功。为了确认YAP与巨噬细胞极化的关系，本研究应用诱导成功的M1型和M2型巨噬细胞，检测YAP在不同表型巨噬细胞中的表达差异，结果发现，无论在mRNA水平还是蛋白水平，YAP在M1型巨噬细胞中的表达均低于M2型巨噬细胞，提示YAP可能与M2型巨噬细胞的表型维持有关。为了进一步确认YAP在巨噬细胞极化中的作用，本研究将YAP表达质粒转染至M1型巨噬细胞，结果发现，在M1型巨噬细胞中过表达YAP，可抑制M1型巨噬细胞标志物IL-1β mRNA和蛋白的表达水平，但同时可增加M2型巨噬细胞标志物CCL22 mRNA和蛋白的表达水平，提示YAP可能抑制M1型巨噬细胞的形成和促进M2表型形成。

综上所述，Hippo信号通路关键蛋白YAP表达高低可调控巨噬细胞极化，YAP表达升高可抑制M1型巨噬细胞的形成和促进M2表型形成。