刘莹莹，刘伟

不完全性脊髓损伤（incomplete spinal cord injury，iSCI）是脊髓损伤中相对较轻的一类致残性疾病，多表现为损伤平面以下神经节段感觉区域顽固性触发性疼痛、自发性痛或痛觉过敏（痛超敏）及运动功能障碍[1,2]。本研究通过观察低、中、高频督脉电针对iSCI模型大鼠凝血功能、痛超敏行为学的影响，探讨其改善运动功能的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

1.1.1 实验动物及分组 SPF 级雄性Wistar 大鼠50只，7周龄，体质量（230.5±5.5）g，由湖北省实验动物中心提供[合格证号:SCX K(鄂)2019-0005，福利伦理审批号2017-59]。采用随机数字表法将大鼠随机分为假手术组，模型组和低、中、高频电针组（G1、G2、G3组），各组10只。实验遵守3R原则，需满足动物福利。

1.1.2 实验器材及药品 主要有：旷场实验分析系统（上海洛维生物科技有限公司，型号：XR-XZ301）；Noraxon 表面肌电测试仪（美国，上海涵飞医疗器械有限公司，型号：MyoTraceTM 400）；von Frey hair（纤毛机械刺激针，瑞典）；风途FT-SY96A 酶联检测仪（山东风途物联网科技有限公司）；LH202H-四导韩氏穴位神经刺激仪（北京华运安特有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模 3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉大鼠，固定；定位T11棘突，标记T9～T12手术区域，常规备皮、碘伏消毒、铺无菌巾。以T11棘突为中心区行脊正中皮肤纵行切口，分离浅肌层，暴露T9～T12棘突和椎板，游离T11椎板上下缘并咬去椎板棘突暴露T11节段脊髓，用美国NYU脊髓冲击损伤仪的击打（250 g·mm）悬空固定的T11节段脊髓[3]。造模成功标志参考文献[4,5]：脊髓表面肉眼可见圆形或椭圆形血肿，击打脊髓时鼠尾出现一过性摆动、后肢痉挛性抽搐后完全松弛。假手术组仅行椎板全切除术。术后缝合皮肤、碘伏消毒。肌注20万U青霉素，1次/d，共3 d。

1.2.2 治疗 术后第7天，用大鼠固定器固定清醒G1、G2、G3 组大鼠，参照《实验针灸学》，于第7 颈椎与第1胸椎背部正中选“大椎穴”；第2、3 腰椎棘突间背部正中选“命门穴”。用0.3 mm×1 mm毫针，用捻针法缓慢进针，进针深度应达硬膜外。然后接四导韩氏穴位神经刺激仪（大椎接正极，命门接负极），分别予低（2 Hz，2 mA）、中（50 Hz，2 mA）、高（100 Hz，2 mA）频电针治疗，连续波，以双下肢肌肉出现节律性收缩或下肢轻微抖动为度，30 min/次，1 次/d，共治疗2周。假手术组和模型组固定30 min，但不治疗。

1.2.3 痛超敏行为学观察 以治疗结束后大鼠出现自发嘶叫及对T11节段以下躯体、后肢和尾部舔咬、搔抓甚至自噬等异常行为学改变为阳性体征，并记录发生次数。

1.2.4 痛阈检测 治疗结束后采用标准化von Frey hair 痛阈测定方法，测量损伤躯干下端机械性轻触皮肤、轻压皮肤、机械轻压右前爪的机械痛痛阈阈值3项指标。

1.2.5 行为学实验 ①斜板实验：治疗结束后将大鼠头朝左横放于与纵轴垂直的斜板上，然后从0°起、每次增加5°，逐渐增大斜板斜角，期间以大鼠停留在木板上5 sec 不滑落的斜角为有效角度，实验重复3 次取其平均值。②BBB（Basso Beattie Bresnahan）功能评分：治疗结束后将大鼠放入旷场内适应环境1 周，由专门训练的实验人员进行评定，BBB分值越高说明运动功能恢复的越好[6]。

1.2.6 表面肌电测试 治疗结束后固定清醒大鼠，剃去右后肢鼠毛、酒精脱脂。在股直肌在膝关节与骼前上棘连线中点，股二头肌在胭窝中点与股骨大转子连线分别接测试电极，用Noraxon 表面肌电测试仪记录股二头肌（biceps femois，BF）和股直肌（reoctns femois，RF）的肌电积分值（integoted，IEMG）：BF-TEMG 和RF-TEMG。

1.2.6 凝血功能检测 在表面肌电测试完成后进行。①断尾、用玻片接少量血液，用5 号针头轻轻挑起，以出现丝状物为凝血时间（clotting time，CT）；以断尾处不再出血为出血时间（bleeding time，BT）。②凝血酶和内/外源性凝血因子Xa活性检测：断尾后准确吸取200 μL，取上述全血中105个全血细胞，分别加入含5 mmol/L CaCL2及1 nmol/L 凝血酶原的缓冲液孵育10 min，加EDTA 终止，然后加入0.8 mmol/L 的S2238，酶标仪波长405 nim，测定凝血酶。再取105个全血细胞加入0.2 nmol/L 凝血酶（IIa）、l nmol/L 因子IXa、5 nmol/L 因子Ⅷ和130 nmol/L 因子X 的缓冲液孵育，10 min 后用7 mmol/L的EDTA终止；加显色底物，405 nm波长分别测定内/外源性凝血因子Xa[7]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0软件，符合正态分布以及方差齐性的计量资料以（±s）表示，单因素方差分析，两两比较采用采用SNK-q检验；不满足方差齐性的数据采用Dunnett C 检验和Games-Howell 检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同频率督脉电针对iSCI大鼠运动功能的影响

模型组斜角和BBB 评分显著低于假手术组（P＜0.05）。G1、G2 和G3 组斜角和BBB 评分高于模型组（P＜0.05）；G1 组斜角和BBB 评分高于G2 和G3 组（P＜0.05），G2 和G3 组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠BBB评分和斜板实验结果比较（±s）

表1 各组大鼠BBB评分和斜板实验结果比较（±s）

注：与假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与G3组比较，③P＜0.05；与G2组比较，④P＜0.05

组别假手术组模型组G3组G2组G1组只数10 10 10 10 10 BBB/分18.90±1.19 7.68±0.54①11.78±1.47②12.09±0.92②14.75±1.42②③④斜角/度66.04±5.21 28.08±1.47①43.55±2.73②41.78±1.98②52.05±4.64②③④

2.2 不同频率督脉电针对iSCI大鼠痛超敏行为学异常改变的影响

模型组大鼠出现搔抓、舔咬损伤平面以下部位并对尾部及后肢出现自噬及自发嘶叫现象较假手术组增多（P＜0.05）。G1、G2和G3组大鼠的上述现象则较模型组明显降低（P＜0.05）；G1 组大鼠的上述现象低于G2 和G3 组（P＜0.05），但G2 和G3 组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠痛超敏行为学异常改变比较（次, ±s）

表2 各组大鼠痛超敏行为学异常改变比较（次, ±s）

注：与假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与G3组比较，③P＜0.05；与G2组比较，④P＜0.05

组别假手术组模型组G3组G2组G1组只数10 10 10 10 10自发嘶叫0.54±0.01 12.01±1.17①9.01±0.90②8.73±0.85②6.46±0.22②③④搔抓4.59±0.24 19.60±1.53①13.67±1.36②14.91±0.95②10.80±1.59②③④组别假手术组模型组G3组G2组G1组舔咬1.50±0.04 15.69±1.65①11.81±1.52②10.61±1.93②8.90±0.92②③④自噬0.00±0.00 9.60±1.24①8.91±1.01②8.79±0.58②6.87±0.71②③④

2.3 不同频率督脉电针对iSCI大鼠机械痛阈值的影响

模型组大鼠机械痛阈值明显降低，其对损伤躯干下端机械性轻触皮肤、轻压皮肤、机械轻压右前爪的机械痛痛阈阈值均较假手术组显著降低（P＜0.05）。G1、G2 和G3 组大鼠的上述阈值均高于模型组（P＜0.05）；G1组高于G2和G3组（P＜0.05），但G2和G3组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 各组大鼠机械痛阈值比较（g, ±s）

表3 各组大鼠机械痛阈值比较（g, ±s）

注：与假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与G3组比较，③P＜0.05；与G2组比较，④P＜0.05

组别假手术组模型组G3组G2组G1组只数10 10 10 10 10机械轻压右前爪65.90±4.89 17.56±1.87①33.78±1.80②34.65±2.10②40.76±4.29②③④组别假手术组模型组G3组G2组G1组轻触皮肤72.50±4.09 15.69±1.38①24.78±2.04②25.69±1.97②31.82±2.37②③④轻压皮肤65.32±5.27 8.69±1.45①29.04±3.07②28.64±2.95②34.81±2.74②③④

2.4 不同频率督脉电针对iSCI 大鼠BF-TEMG 和RF-TEM的影响

模型组BF-TEMG 和RF-TEM 较假手术组明显降低（P＜0.05）。G1、G2 和G3 组大鼠的BF-TEMG 和RF-TEM高于模型组（P＜0.05）；G1组高于G2和G3组（P＜0.05），但G2 和G3 组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 各组大鼠BF-TEMG和RF-TEM检测结果比较（μv, ±s）

表4 各组大鼠BF-TEMG和RF-TEM检测结果比较（μv, ±s）

注：与假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与G3组比较，③P＜0.05；与G2组比较，④P＜0.05

组别假手术组模型组G3组G2组G1组只数10 10 10 10 10 BF-TEMG 120.86±7.39 66.18±3.70①94.54±5.61②96.02±4.98②113.98±7.43②③④RF-TEM 176.23±11.24 75.03±5.57①121.57±9.36②123.91±7.45②147.70±8.56②③④

2.5 不同频率督脉电针对iSCI大鼠凝血功能的影响

与假手术组相比，模型组内/外源性凝血因子Xa和凝血酶生成明显增多，CT和BT缩短（P＜0.05）。与模型组相比，G1、G2 和G3 组大鼠内/外源性凝血因子Xa和凝血酶生成降低，CT和BT延长（P＜0.05）；G1组改变幅度大于G2 和G3 组（P＜0.05），但G2 和G3 组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

3 讨论

SCI是一种严重的中枢神经系统疾病，致残率高[8]。中医学将其归属于“痿证”范畴。督脉属奇经八脉之首，汇集全身阳气。脊髓与督脉的功能相似，iSCI 与“痿证”相符，也可视之为“督脉损伤”[9]。比较不同刺激频率督脉电针治疗iSCI有一定的临床指导意义。

表5 各组iSCI大鼠凝血功能改变比较（±s）

表5 各组iSCI大鼠凝血功能改变比较（±s）

注：与假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与G3比较，③P＜0.05；与G2组比较，④P＜0.05

组别假手术组模型组G3组G2组G1组只数10 10 10 10 10 CT/s 78.84±5.39 67.64±4.26①70.31±5.07②70.75±4.27②74.50±3.44②③④BT/s 816.75±32.75 633.45±29.07①707.84±30.02②710.19±33.45②780.71±27.86②③④凝血酶/U 9.41±0.96 17.53±2.46①14.73±1.08②13.92±1.67②10.37±0.95②③④内源性凝血因子Xa/(pg/mL)49.81±2.09 60.59±4.13①55.07±1.22②57.78±2.74②53.23±2.80②③④外源性凝血因子Xa/(pg/mL）42.09±2.76 54.38±3.80①48.79±1.30②47.48±2.83②45.15±1.67②③④

本实验模型组大鼠出现典型的“督脉损伤”，如痛超敏行为学异常、痛阈阈值降低、凝血功能异常亢进等现象。大鼠肌力和肢体协调性下降、运动功能损伤严重。经治疗，G1、G2、G3组大鼠凝血功能恢复，痛超敏行为学、BF-TEMG、RF-TEM 及痛阈阈值均有不同程度改善，大鼠运动功能也明显恢复。提示低、中、高频电针均可改善微环境并促进iSCI 大鼠运动功能恢复，但低频督脉电针（G1组）的作用优于中、高频。研究表明，督脉电针可改善脑部血液循环，促进脑脊液流动和SCI 部位水肿消退，使运功和感觉得到一定程度的恢复[10,11]。另外，iSCI可导致下肢骨骼肌萎缩及微循环障碍，表现为肌力下降，肢体协调性降低，如斜板倾斜度及BF-TEMG、RF-TEM 降低[12,13]；而后者可能形成严重的下肢静脉血栓，也是影响运动功能恢复的重要因素[14]。低频督脉电针可能是通过改善凝血功能，使损伤部位血液流动性增强，减少因凝血亢进而引起的气血淤堵现象，化生气血促进损伤部位血液循环和神经功能的恢复。也可通过提高大鼠痛阈而减轻iSCI痛超敏行为学改变，这有利于损伤部位神经水肿及炎症消除。电针仪输出电流可唤醒受损脊髓神经元的觉醒，恢复其兴奋和传导，这有利于肢体运动功能的恢复，“既可培补真阳，又可疏通脏腑经气，阳气上下贯通”[15]。

综上所述，督脉电针改善iSCI 大鼠运动功能的可能机制是：改善亢进凝血功能-化生气血促进损伤部位血液循环和神经功能的恢复-提高痛阈-减轻iSCI痛超敏-肌力增强-逐步恢复运动功能。在这一作用过程中，低频督脉电针疏通“督脉损伤”引起的淤阻、改善微环境及增强肢体协调性以促进运动功能重建方面作用优于中、高频督脉电针。