解晓霜

摘  要：菌株是食品检测微生物实验室检验工作中不可缺少的重要生物资源，常用于培养基的验收、试验对照、人员培训考核、方法确认等方面的质量控制。因此为了确保工作菌株的生物特性和纯度、实现工作菌株方便快捷地使用和溯源 ，菌株的相关管理工作在微生物实验室就显得尤为重要，按统一操作程序制备的菌株是微生物试验结果一致性的重要保证。本文简要阐述了食品检测微生物室在检验工作中对菌株管理和使用的方法。

关键词：菌株;管理;使用;方法

1前言

CNAS-CL01-A001-2018《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》中明确要求：实验室必须保存有满足试验需要的标准菌种/菌株（标准培养物），除检测方法中规定的菌种外，还应包括应用于培养基（试剂）验收/质量控制、方法确认/证实、阳性对照、阴性对照、人员培训考核和结果质量的保证等所需的菌株。故菌株的规范管理和使用直接关系到食品微生物检测的质量，以下将从实际工作中阐述菌株的管理和使用流程和方法。

2标准菌株的获取

标准菌株应来自认可的国内或国外菌种保藏机构。如：中国医学细菌保藏管理中心（CMCC）、美国标准菌种保藏中心（ATCC）。菌株购买前需根据实验室检测需求制定采购计划，经审批后，向认可的国内或国外的菌种保藏机构购买标准菌株。标准菌株到达实验室后，菌种管理人应检查其名称、数量以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息填写记录（包括菌种名称、编号、数量、代数、来源、接收日期、接收人等），并将其贮存在规定温度的冰箱里，首次购买的菌株冻干粉一般保存在2～8℃冰箱中。

3标准菌株的复苏、复壮和保存

标准菌株的复苏、复壮或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。复苏、复壮应选择营养成分丰富且全面的培养基（例如：TSA/TSB/NA/NB/SDB/SDA等），一般不使用选择性较强的培养基;特殊的一些菌株在普通的培养基上生长不好，可能还需添加生长因子。

标准储备菌株复苏后应先进行纯度和特性确认。纯度确认包括：平板划线查看菌落形态、革兰氏染色、显微镜观察菌体形态等;关键特性确认可选择：特征生化反应确认、试剂盒鉴定、菌种鉴定仪鉴定等。需要注意的是，从开启、复苏、复壮到纯度和特性的确认，都应做好实验记录。

标准储备菌株保藏的方法有很多，包括定期移植法、液体石蜡法、磁珠保藏法、冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏、-80℃低温保藏法，食品检测微生物室一般采用比较多的是磁珠保藏法，并置于-80℃条件下，可以实现长期保存的目的，一般保存周期可达10年。方法是取适量复苏经过确认的菌悬液置于磁珠管中，加盖充分摇晃，使菌株吸附于磁珠中，再将管中菌液吸出，加盖并贴上含菌株信息的标签，迅速置于-80℃冰箱保存。菌种应设专人管理，菌种保藏的地点应采取一定的措施使非管理者不能轻易获取，例如加锁保管，双人保管等。

标准储备菌株可用于制备每月或每周1次转种的工作菌株。每次使用时取一颗磁珠置于复苏液培养即可，并做好记录。注意取完磁珠尽量在最短时间内将剩余磁珠放回-80℃冰箱中，以防长时间的温度变化对菌株造成伤害。从保藏机构获取的冻干菌种为0代菌种，每转接一次增加一代（1代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何形式的转种均被认为传代一次），工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代，以防止过度的传代增加菌株变异的风险。

4标准菌株的衰退和销毁

菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种衰退。菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程。菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。合理的育种、选用合适的培养基、创造良好的培养条件、采用有效的菌种保藏方法等可以有效的防止菌种的退化。

菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演變过程。开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。

菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降;如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。菌种在移种传代过程中会发生自发突变。虽然自发突变的几率很低（一般为10-6～10-9），尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退了的菌株。造成菌株衰退的原因还包括了表型延迟、质粒脱落、连续传代、不适宜的培养和保藏条件等。

若标准菌株如果经过确认试验证明已经老化、退化、变异、污染等或该菌株已无使用需要时，应及时灭菌销毁并做好记录。

5菌株保藏的基本原则

微生物菌种的操作需符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《人间传染的病原微生物》和《动物病原微生物分类名录》以及GB 19486的有关要求。此外针对微生物菌种的特性选择适宜的保藏方法，以保持菌种自身性状的稳定。另外微生物菌种的保藏工作不能对周围的环境造成污染和伤害。

6总结

菌种每次转种传代，必须做纯度、特性等实验室所需关键指标的确认，实验室应建立菌种管理（从标准菌株到工作菌株）的文件和记录，内容包括菌株的申购、进出、收集、贮藏、确认、转种、使用以及销毁等全过程。每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、传代数，并记录菌种生长的培养基和培养条件、菌种保藏的位置和条件等信息，同时全过程要保证生物安全。

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