逯文倩，王 娟

（山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东淄博 255000）

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）营养价值高、口感好、种植简单、价格低，是世界上最畅销的食用菌之一[1]。但双孢蘑菇含水率高且没有明显的保护组织，易受微生物侵染而腐烂，影响商品价值，有研究发现，双孢蘑菇在室温下的贮藏期只有3 d[2]。目前关于双孢蘑菇的保鲜方法有很多，如气调保鲜、低温保藏、化学保鲜等[3-4]。但由于环境和成本问题，人们愈发关注天然和可再生材料制成的抗菌生物高分子保鲜膜。与合成塑料相比，以多糖、蛋白质和脂类为原料制备的生物可降解聚合物膜具有更好的生物相容性、生物降解性和环境友好性等优点[5-7]。

海藻酸钠是一种从海藻或细菌中提取的天然多糖，由D-甘露糖醛酸（M）和L-古洛糖醛酸（G）组成[8]，具有优良的成膜性和可再生性，是最受欢迎的膜材料之一[9]，然而高水敏性、较差的抗氧化性和抗菌性限制了海藻酸钠生物膜的应用[10-12]。为改善海藻酸钠膜的性能，可以在膜中加入纳米粒子。MSNPs 的粒径可控、化学稳定性好、生物相容性好、表面具有大量的孔道，能够负载大量的活性物质[13-14]。OEO 具有良好的抗菌和抗氧化活性，是一种安全、高效、无毒的天然食品防腐剂，然而精油具有较强的挥发性和特殊气味，使其作为食品添加剂的应用受到限制[15-17]。将OEO 负载于MSNPs 的孔隙中能防止精油降解或挥发，延长抗菌时间。

本文主要研究了纯海藻酸钠膜与0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜对双孢蘑菇贮藏期间生理品质的影响，为其在延长采后双孢蘑菇保鲜期方面的研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜双孢蘑菇采自山东省淄博市临淄区，采后立即将其运至冷库，在（4±1）℃条件下预冷12 h 备用。

海藻酸钠，天津光复化学试剂有限公司；OEO，江西环球天然香料有限公司；原硅酸四乙酯（TEOS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和NH4OH，美国Sigma Aldrich公司；SOD 试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

C-MAGHS4 型磁力搅拌器，德国汉堡有限公司；BSC-150 型恒温恒湿箱，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；UV-2550 型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；SHJ-6 型水浴磁力搅拌器，常州国宇仪器制造有限公司；TGL-16K 型高速低温离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Multiskan GO 型酶标仪，美国Thermo Scientific 公司。

1.3 方法

1.3.1 MSNPs 和OEO-MSNPs 的制备

取6.0 g CTAB，125 mL 无水乙醇，30 mL NH4OH 和125 mL 蒸馏水混合于500 mL 烧杯中，用磁力搅拌器1 500 r/min 搅拌10 min 后逐滴加入8.5 g TEOS 到混合液中搅拌2 h。搅拌后的溶液放入净化釜中，105℃烘干48 h，超滤得到固体颗粒，蒸馏水洗涤3 次，105 ℃烘干后用马弗炉在550 ℃下煅烧4 h 得到MSNPs。

将600 μL OEO 加入到200 mg MSNPs 中，再加入2 mL 氯仿，于10 mL 离心管中制成混合溶液。用超声波清洗机在100 W、20 kHz 下对混合物超声处理40 min。有机溶剂蒸发后得到OEO-MSNPs。

1.3.2 OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜的制备

采用溶剂浇铸法制备海藻酸钠膜[8]。准确称取0.8 g OEO-MSNPs 缓慢加入100 mL 蒸馏水中，用磁力搅拌器以1 500 r/min 搅拌20 min，得到均匀的OEO-MSNPs悬浮液。随后在悬浮液中加入2.5 g 海藻酸钠粉末，用水浴磁力搅拌器在1 000 r/min、60 ℃条件下搅拌40 min。待混合物冷却至室温后加入7 mL 甘油搅拌至溶液清晰透明，最后将膜液倒在水平的玻璃模具（25 cm×25 cm）内，40 ℃干燥12h。然后将薄膜用5%氯化钙溶液交联70s，在25 ℃、50%的相对湿度下干燥4 h，揭膜，得到0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠膜。

1.3.3 不同复合膜对双孢蘑菇的包装保鲜试验

选择大小均匀、无病虫害和机械损伤的双孢蘑菇，在（4±1）℃冷库中预冷24 h。样品随机分为3 组，每组约20 个蘑菇子实体。分别用纯海藻酸钠膜（处理组F1），0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜（处理组F2）、空白对照组（CK）在（4±1）℃下贮藏双孢蘑菇12 d，空白对照组未进行任何包装处理。每3 d 取样1 次，用于测定各项生理指标，每项指标重复测定3 次。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 呼吸速率

双孢蘑菇的呼吸速率采用Hu 等[18]的方法测定。取每个处理组中大小相同的5 个双孢蘑菇放置在密闭容器中，然后用手持O2/CO2测定仪测定容器中2 h 内的气体成分变化，单位为mg CO2/(kg·s)，计算公式如式（1）所示。

式中，ΔC-密闭容器中CO2体积分数变化量，%；V-密闭容器中气体体积，mL；m-子实体质量，g；Δt-密闭时间，s；44-CO2相对分子质量，g/mol；22.4-气体摩尔体积，L/mol。

1.4.2 失重率

采用称量法[19]测定，计算公式如式（2）所示。

式中，m0-第0 天时双孢蘑菇鲜质量，g；mt-取样时双孢蘑菇鲜质量，g。

1.4.3 色度

用手持色差仪分别对蘑菇的表皮和果肉的L、a、b进行记录。白度（WI）根据公式（3）计算。

1.4.4 硬度

用TPA 质构仪和直圆柱形探头，选择压缩模式对双孢蘑菇的硬度进行测试。参数：测前速度5 mm/s，测试速度5 mm/s，测后速度5 mm/s；下压接触力5 N，形变量80%；两次挤压间隔时间0.2 s。

1.4.5 总酚、类黄酮含量

称取0.5 g 双孢蘑菇，加入15 mL、80%乙醇溶液，冰浴下研磨并在4 ℃、5 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液进行总酚、类黄酮含量的测定。

总酚含量采用福林酚法测定[19]。0.4 mL 上清液加入2 mL、10%福林酚溶液中，振荡摇匀后静置于黑暗环境中5 min，加入1.8 mL、7.5%Na2CO3溶液，振荡摇匀后静置于黑暗环境中1 h，于765 nm 下测定其吸光度值。采用标准没食子酸溶液为标准曲线。总酚含量按公式（4）计算。

式中，C-根据标准曲线得到的没食子酸质量，mg；V-提取液总体积，mL；V1-测定所取的提取液体积，mL；M-双孢蘑菇质量，g。

测定类黄酮采用分光光度法[20]。取1 mL 上清液加入0.3 mL、5%NaNO2溶液中，振荡摇匀后静置于黑暗环境中5 min，加入0.3 mL、10%AlCl3溶液，振荡摇匀后静置于黑暗环境中5 min，再加入2 mL、1 mol/L NaOH 溶液和3.4 mL 蒸馏水，振荡摇匀后静置于黑暗环境中1 h，于510 nm 下测定吸光度值。采用芦丁标准溶液做标准曲线。类黄酮含量按公式（5）计算。

式中，C-根据标准曲线得到的芦丁质量，mg；V-提取液总体积，mL；V1-测定所取的提取液体积，mL；M-双孢蘑菇质量，g。

1.4.6 细胞膜透性

用1 cm 的打孔器将双孢蘑菇菌盖切成厚度为0.3 cm的小圆片。称取1.0 g 蘑菇圆片放入25 mL 蒸馏水的离心管中，用电导率仪测得电导率EC0。然后于25 ℃缓慢振荡1 h，测定电导率EC1。再于沸水浴中加热30 min，冷却至室温后将蒸馏水补至25 mL，测定电导率EC2。相对电导率按照公式（6）计算。

1.4.7 丙二醛（MDA）

取1.5 g 双孢蘑菇，加入6 mL、10%三氯乙酸溶液，冰浴研磨。在4 ℃、10 000 r/min 条件下离心15 min，取上清液用于MDA 含量的测定。

取2 mL 上清液，加入2 mL、0.6%2-硫代巴比妥酸溶液，沸水浴10 min，随后冷却至室温，在4 ℃、10 000 r/min条件下离心5 min，取上清液分别在450、532、600 nm 下测定OD 值。MDA 浓度（c）根据经验公式（7）计算，MDA含量根据公式（8）计算。

式中，c-公式（7）得到的MDA 浓度，μmol/L；V-样品提取液总体积，mL；m-双孢蘑菇质量，g。

1.4.8 抗氧化性

取1.0 g 双孢蘑菇，加入6 mL、0.05 mol/L 磷酸钾缓冲液（pH 7.8，含5%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）），冰浴研磨，在4 ℃、10 000 r/min 条件下离心20 min，取上清液进行多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性的测定。

取0.5 mL 上清液，加入3 mL、0.12 mol/L 邻苯二酚溶液（pH 4.5），立刻摇匀，在410 nm 下测定OD 值，每30 s读数，记录3 min 内的变化。PPO 活性以每分钟OD 值变化0.01 为一个活性单位U，用U/g 表示。PPO 活性按照公式（9）计算。

式中，ΔA410-每分钟OD 值的变化值；V-样品提取液总体积，mL；V1-测定时所取提取液体积，mL；m-双孢蘑菇质量，g。

取0.4 mL 上清液，加入2.8 mL、0.25%愈创木酚溶液（pH 5.4）和0.1 mL、0.75%H2O2溶液，立即摇匀，在470 nm下测定OD 值，每30 s 读数，记录3 min 内的变化。POD酶活以每分钟OD 值变化0.001 为一个活性单位U，用U/g 表示。结果按公式（10）计算。

式中，ΔA470-每分钟OD 值的变化值；V-样品提取液总体积，mL；V1-测定时所取提取液体积，mL；m-双孢蘑菇质量，g。

取0.2 mL 上清液，加入1.5 mL、0.05 mol/L 磷酸钾缓冲液（pH 7.0）和0.3 mL、0.01 mol/L H2O2溶液，立即摇匀，在240 nm 下测定OD 值，每30 s 读数，记录OD 值在3 min内的变化。CAT 酶活以每分钟OD 值变化0.01 为一个活性单位U，用U/g 表示。CAT 活性按公式（11）计算。

式中，ΔA240-每分钟OD 值的变化值；V-样品提取液总体积，mL；V1-测定时所取提取液体积，mL；m-双孢蘑菇质量，g。

SOD 测定方法依照试剂盒说明进行。

1.4.9 菌落总数

从每个包装中取1.0 g 双孢蘑菇，捣碎并与10 mL、0.1%蛋白胨水混合。8 000 r/min 均质2 min，取9 mL 蛋白胨水将样品从10-1浓度连续稀释到10-9。选取2～3 个适宜稀释度的样品匀液，各吸取1 mL 于无菌PDA 培养基中，均匀涂布。在28 ℃下培养5 d，进行菌落计数。

1.5 数据分析

使用SPSS（Version 11.5，SPSS Inc.，Chicago，USA）进行统计学分析。所有试验重复3 次。利用Duncan 法进行方差分析，P＜0.05 被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜对双孢蘑菇呼吸速率和失重率的影响

图1a 所示，随着贮藏时间的延长，各处理双孢蘑菇的呼吸速率均呈现先升高后降低的趋势，CK、F1 和F2处理的呼吸高峰分别出现在第6、6、9 天，其大小分别为0.010 8、0.008 4、0.006 8 mg CO2/(kg·s)。可见，0.8%OEOMSNPs/海藻酸钠复合膜能显著抑制双孢蘑菇呼吸强度的变化（P＜0.05），并延缓了呼吸高峰的出现。这可能是因为0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜能维持高CO2、低O2的气体环境，抑制了双孢蘑菇呼吸相关的酶活性及代谢[21]。

如图1b 所示，在整个贮藏期间，各处理双孢蘑菇的失重率均呈上升趋势，相比于CK 处理，所有的海藻酸钠膜处理显著抑制了失重率的增加（P＜0.05）。第12 天时，CK、F1 和F2 的失重率分别为19.78%、14.31%和6.95%，这可能与海藻酸钠膜处理影响了双孢蘑菇呼吸速率有关，低呼吸强度减少了营养底物的损耗。司金金等[22]研究发现微孔包装袋较PE 保鲜膜中红薯叶失重率高，主要因为微孔包装袋透气性好，更有利于红薯叶的呼吸作用和蒸腾作用，造成了较大的水分损耗。Wang 等[23]使用1.5%壳聚糖单独或联合10 mmol/L 抗坏血酸涂膜处理鸭梨，结果表明不同涂膜处理均延缓了果实的质量损失。另外这也与膜的水蒸气透过率有关，低水蒸气透过率可以维持一定的水分湿度，从而抑制双孢蘑菇的水分散失[24]，0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠膜水蒸气透过率较低也证实了这一点。

图1 不同处理对双孢蘑菇呼吸速率（a）和失重率（b）的影响Fig.1 Effect of different treatments on respiration rate (a)and weight loss rate (b) of Agaricus bisporus

2.2 OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜对双孢蘑菇白度的影响

双孢蘑菇采收后极易褐变，造成菇体白色的丧失，影响双孢蘑菇的市场价值。双孢蘑菇贮藏期间菇皮和菇肉部位的白度变化如图2 所示，所有处理双孢蘑菇的白度值均逐渐减小，海藻酸钠膜处理在一定程度上延缓了双孢蘑菇白度的降低。而OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜处理则更好地维持了菇皮和菇肉的白度，较对照组具有显著性差异（P＜0.05）。在整个贮藏期间仅降低9.26 和9.42，分别为CK 和F1 处理的48.0%、66.6%和47.3%、85.6%。这可能是因为0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜形成了低O2的环境，从而抑制了双孢蘑菇酶促褐变的发生[25]。Nasiri 等[26]在黄芪胶溶液中添加不同浓度薄荷精油对双孢蘑菇进行涂膜处理，结果也表明涂膜能够延缓双孢蘑菇褐变现象的出现。

图2 不同处理对双孢蘑菇菇皮（a）和菇肉（b）的白度指数影响Fig.2 Effect of different treatments on whiteness of Agaricus bisporus surface (a) and flesh (b)

2.3 OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜对双孢蘑菇硬度的影响

硬度是反映双孢蘑菇品质的重要参数，双孢蘑菇采后软化严重，极大地影响了其商品价值。各处理双孢蘑菇的硬度随贮藏时间延长逐渐降低，与对照组相比，0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜包装双孢蘑菇的硬度下降速度显著减缓（P＜0.05）。如图3（见下页）所示，第12 天时，0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠膜处理双孢蘑菇的硬度值为25 471 g，高于CK 组双孢蘑菇在第6 天的硬度值（24 547 g），将双孢蘑菇的软化进程延缓了6 天。另外，贮藏环境中的高CO2对软化相关酶活性的抑制也可能是一个重要原因。

图3 不同处理对双孢蘑菇硬度的影响Fig.3 Effect of different treatments on hardness of Agaricus bisporus

2.4 OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜对双孢蘑菇总酚和类黄酮含量的影响

图4 不同处理对双孢蘑菇总酚（a）和类黄酮（b）含量的影响Fig.4 Effect of different treatments on total phenolic content(a) and flavonoid content (b) of Agaricus bisporus

酚类物质和类黄酮物质是双孢蘑菇中极为重要的抗氧化物质，在抵御外界不利环境胁迫、内部氧化胁迫以及病原菌侵染等方面均发挥着重要作用[27-28]。图4 反映了各处理双孢蘑菇在贮藏期间总酚和类黄酮含量的变化。随着贮藏时间的延长，各处理双孢蘑菇的总酚和类黄酮含量均呈下降趋势。相较于CK 组和海藻酸钠膜处理组，0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠膜处理组双孢蘑菇在整个贮藏期间均维持了最高的总酚和类黄酮含量（P＜0.05）。这可能是因为海藻酸钠膜中加入的OEO 具备了优良的抗氧化性能，在缓释过程中与双孢蘑菇外源接触，刺激了双孢蘑菇苯丙烷类代谢的途径，进而合成了更多的抗氧化次级代谢产物。同时，这可能也与0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠膜抑制了双孢蘑菇的呼吸速率有关，双孢蘑菇低代谢强度减缓了活性氧对抗氧化物质的氧化能力降低酚类物质和类黄酮物质的损耗。

2.5 OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜对双孢蘑菇细胞膜透性和MDA 含量的影响

图5 不同处理对双孢蘑菇相对电导率（a）和MDA 含量（b）的影响Fig.5 Effect of different treatments on relative conductivity(a) and MDA content (b) of Agaricus bisporus

细胞膜透性是反映膜系统完整性的指标，可以反映果实的损伤程度[18]。MDA 是膜脂过氧化的最终产物，可以间接反映组织的过氧化损伤程度[29]。图5 显示在整个贮藏期间，各处理双孢蘑菇的相对电导率和MDA 含量均呈升高趋势，其中，0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜处理显著延缓了相对电导率和MDA 含量的增加（P＜0.05）。如图5 所示，第12 天时，0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜处理组的双孢蘑菇相对电导率和MDA 含量比0 天增加13.5%和47.9%；而海藻酸钠膜处理组和CK组比0 天分别增加了19.1%、91.7%和21.9%、135.4%。这是因为0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜处理的双孢蘑菇维持了更高的总酚和类黄酮含量，具备更强的抗氧化和清除自由基的能力，进而缓解了双孢蘑菇受到的氧化胁迫。另外，0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜具备一定的抑菌活性，也在一定程度上避免了由于病原菌侵染而产生的伤害。

2.6 OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜对双孢蘑菇PPO、POD、SOD 和CAT 活性的影响

PPO 是双孢蘑菇采后褐变的主要原因，酚类物质在PPO 的催化氧化下，最终生成对应的醌类物质，导致双孢蘑菇商品价值降低[30]。双孢蘑菇PPO 活性的变化如图6a所示，由图知，随着贮藏时间的延长，各处理PPO 的活性均逐渐升高，CK 组的PPO 活性增加最快，而0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜处理更好地延缓了PPO活性的增加，具有显著性差异（P＜0.05）。这说明0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜能够显著抑制PPO 活性升高，从而抑制双孢蘑菇的褐变。王韵仪等[31]研究发现茶多酚/川陈皮素/羧甲基纤维素复合膜可以有效减缓PPO活性的升高，抑制刺嫩芽的褐变。

POD、SOD 和CAT 是双孢蘑菇中几种重要的抗氧化酶，可以将双孢蘑菇内产生的高毒性自由基和过氧化物转化成低毒性或无毒的物质，在延缓食用菌采后衰老中发挥着至关重要的作用。SOD 负责将超氧阴离子转化成H2O2，而CAT 和POD 负责将H2O2转化成H2O。各处理组双孢蘑菇POD、SOD 和CAT 活性的变化如图6b、c 和d所示，由图可知，在整个贮藏期间，POD、SOD 和CAT 活性均呈先升高后降低的趋势，SOD 和CAT 活性分别在第3 天和第6 天达到峰值然后降低，POD 活性在9 d 内逐渐升高最后略有下降。其中，0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜处理均维持了较高的抗氧化酶活性，CK 组的各种酶活性最低。这可能是因为复合膜中外源添加的OEO-MSNPs 激活了双孢蘑菇的抗氧化系统，在整个贮藏期间维持了较高的抗氧化酶活性，进而延缓了双孢蘑菇贮藏期间的成熟和衰老[32]。另一方面，0.8%OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜处理维持了高抗氧化酶活性，也可能正是双孢蘑菇总酚和类黄酮含量高的一个原因。

图6 不同处理对双孢蘑菇多酚氧化酶（a）、过氧化物酶（b）、超氧化物歧化酶（c）和过氧化氢酶（d）的影响Fig.6 Effect of different treatments on PPO (a),POD (b),SOD (c) and CAT (d) of Agaricus bisporus

2.7 OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜对双孢蘑菇菌落总数的影响

双孢蘑菇感染病原菌易造成子实体腐烂、品质下降，影响商品价值，即使在低温环境下也可能会存在耐低温病菌的侵染。图7 为不同处理对双孢蘑菇低温贮藏期菌落总数的影响。

图7 不同处理对双孢蘑菇菌落总数的影响Fig.7 Effect of different treatments on microbial count of Agaricus bisporus

由图知，随着贮藏期的延长，3 组不同处理的子实体菌落总数均不断上升。但是OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜包装的蘑菇菌落总数上升较缓慢，且显著低于其他2个处理（P＜0.05）。在第12 天时，CK 组菌落总数达12.04 lg（CFU/g），纯海藻酸钠膜处理后的菌落总数为11.36 lg（CFU/g），复合膜包装的菌落总数仅为7.36 lg（CFU/g），表明OEO-MSNPs/海藻酸钠复合膜可以显著抑制双孢蘑菇病原菌数量的增长，能够降低双孢蘑菇因感染微生物导致的腐烂。

3 结论

在本实验中，OEO-MSNPs/海藻酸钠抑菌复合膜对采后双孢蘑菇的保鲜效果均优于其他处理组。与对照相比，复合膜处理能够保持子实体的硬度，这可能与抑制相对电导率、降低MDA 积累有关，同时延缓了总酚、类黄酮含量的降低。复合膜包装后的双孢蘑菇可以有效抑制由PPO 引起的酶促褐变，还可以通过促进POD、SOD 和CAT 活性来提高蘑菇的抗氧化能力。综合各项指标可以看出，海藻酸钠复合膜能够延缓采后双孢蘑菇的衰老，延长其货架期。目前生物活性膜的研究基本停留在实验室阶段，应用于市场包装仍需大量的试验和分析。因此，牛至精油-介孔纳米二氧化硅/海藻酸钠复合膜作为可生物降解的环保包装材料在食品保鲜应用方面具有潜在价值，且符合我国可持续发展战略和环保政策。