李岳，张宪

（北京市药品检验所中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206）

桔贝合剂是临床上常用于治疗呼吸道感染引起的小儿支气管炎、小儿病毒性肺炎的中成药［1–4］，具有较好的润肺止咳功效，且效果明显。桔贝合剂是由桔梗、浙贝母、苦杏仁、麦冬、黄芩、枇杷叶和甘草组成［5–6］，在生产过程中通常加入苯甲酸钠作为防腐剂。苯甲酸钠［7］是药品和食品中一种常用的防腐剂，当pH 值范围为2.5～4.0 时，其防腐效果最佳；当pH 值大于5.0 时，即使浓度增加，其防腐效果也不理想。标准方法［5］中规定桔贝合剂pH 值范围为4.5～5.5，因此其防腐能力不佳，部分生产企业为了延长药品的保质期、防止霉变，可能还会使用其它防腐能力较好的防腐剂，如山梨酸钾、对羟基苯甲酸酯类（对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯）。

苯甲酸钠添加过量会影响人体对钙的吸收以及损害神经系统。部分国家禁止使用苯甲酸钠，我国允许在酱菜类、果菜类和罐头类等食品中使用［9］，规定其限度不得超过0.2%（以苯甲酸计）。对羟基苯甲酸酯类［8］又称为尼泊金酯，是一类高效的杀菌防腐剂，具有抗菌能力强、pH 适用范围广、用量少等优点，但过量使用会导致接触性皮炎；对羟基苯甲酸酯类在化妆品领域的使用较多，经过美国FDA 批准，其限量为不超过0.4%。我国在标准GB 2760–2011 中规定，其在酱及酱制品中最大使用量为0.25 g／kg（以对羟基苯甲酸计）。国家药典中规定药品中山梨酸钾、苯甲酸均不得超过0.3%，羟苯酯类不得超过0.05%［10］。尽管对羟基苯甲酸酯类在化妆品、食品中可以使用，但由于桔贝合剂是儿科用药，儿童身体各种器官免疫相对较弱，为了提高临床疗效和药品安全性，建议不使用对羟基苯甲酸酯类防腐剂，同时应加大对防腐剂的检查。因此准确测定桔贝合剂中防腐剂十分必要。

目前上述防腐剂的测定方法主要有紫外法［11］、红外法［12］、液相色谱法［13］和气相色谱–质谱联用法［14–15］。中成药颜色较深会干扰紫外法测定；红外法定量差；液相色谱法的分析速度慢，检验周期长；气相色谱–质谱法仪器成本高，不易普及。超高效液相色谱是目前分离速度较快的液相色谱，可节省溶剂且缩短筛查时间，目前尚无该方法对桔贝合剂中防腐剂的筛查报道。笔者建立超高效液相色谱法快速筛查桔贝合剂中苯甲酸钠等6 种防腐剂，以期为该用药安全性提供必要保证。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：Waters UPLC H–Class 型，配有DAD 检测器，二元高压洗脱泵，全自动进样器，美国waters 仪器公司。

电子天平：XPE204 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司。

桔贝合剂：10 mL／支，批号分别为180909、181009，181021、1805052、1805035、1806042、1806043、190104、191205、191214，江西诚志永丰药业有限责任公司。

甲醇：色谱纯，美国Fisher 试剂公司。

磷酸二氢钾：优级纯，国药化学试剂公司。

实验所用其它试剂均为分析纯。

实验用水：超纯水，由美国密理博超纯水机制得。

6 种防腐剂对照品：苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的含量和批号见表1，均购于中国食品药品检定研究院，供含量测定用。

表1 6 种防腐剂含量和批号

1.2 仪器工作条件

色 谱 柱：Waters UPLC ACQUITY BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国waters 公司）；柱温：35 ℃；流动相：A 相为甲醇，B 相为0.02 mol／L磷酸二氢钾水溶液（pH 调至3.5），梯度洗脱程序见表2；流量：0.4 mL／min；进样体积：10 μL。

表2 梯度洗脱程序

1.3 溶液制备

1.3.1 对照品溶液

对照品混合溶液：精密称取对羟基苯甲酸甲酯10.32 mg、对羟基苯甲酸乙酯10.15 mg、对羟基苯甲酸丙酯10.28 mg、对羟基苯甲酸丁酯10.07 mg 置于同一25 mL 容量瓶中，加入50%甲醇溶解并稀释至标线，作为羟苯酯类混合对照品储备溶液；精密称取苯甲酸10.26 mg、山梨酸钾13.52 mg 置于同一20 mL 容量瓶中，再精密加入5 mL 上述羟苯酯类混合对照品储备溶液，用50%甲醇溶解并稀释至标线，配制成苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯质量浓度分别为513、676、103.2、101.5、102.8、100.7 μg／mL 的对照品混合溶液。

对照品系列混合工作溶液：分别精密吸取0.1、0.2、1、3 mL 对照品混合溶液于4 只10 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶解稀释，与上述对照品混合溶液作为1#～5#对照品系列混合工作溶液，其中6 种防腐剂质量浓度见表3。

表3 对照品系列混合标准工作溶液 μg／mL

1.3.2 供试品溶液

精密吸取2 mL 桔贝合剂样品溶液（批号为180909）于50 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至标线，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

1.3.3 阴性样品溶液

按照桔贝合剂处方工艺和处方量，制备未加苯甲酸钠防腐剂的样品，作为缺苯甲酸钠的阴性样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

参考食品国家标准和相关文献对液相系统进行考察，分别采乙腈–0.1%磷酸、甲醇–0.1%磷酸和甲醇–0.02 mol／L 磷酸二氢钾作为流动相，结果发现，甲醇–0.02 mol／L 磷酸二氢钾作为流动相时各色谱峰峰形较好。由于苯甲酸、山梨酸均为较强有机酸，流动相的pH 值对其影响较大，酸性较低时其以酸形式存在，当pH 为中性时，其分别以钾盐、钠盐的形式存在。将磷酸二氢钾水溶液的pH 分别调至2.5、3.5 和4.5，结果发现，当pH 值为3.5 时，各色谱峰峰形良好，色谱图基线平稳，分离度大于1.5，理论塔板数高，故选择甲醇–0.02 mol／L 磷酸二氢钾（pH 值调至3.5）为流动相进行测定。

2.2 波长的选择

采用二极管阵列检测器对6 种防腐剂分别在190～300 nm 范围进行扫描，结果发现，苯甲酸分别在197、228 nm 处有最大吸收，山梨酸钾在260 nm处有最大吸收，对羟基苯甲酸甲酯分别在198、254 nm 处有最大吸收，对羟基苯甲酸乙酯分别在196、255 nm 处有最大吸收，对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯均分别在197、255 nm 处有最大吸收，羟苯酯类均在末端具有最大吸收，但选用末端吸收干扰较大，不利于测定，因此选择其次最大吸收波长进行测定；苯甲酸含量较高，综合考虑选择在228 nm波长下测定苯甲酸和山梨酸钾。

2.3 专属性考察

分别取适量1.3 中对照品溶液（A）、供试品溶液（B）、缺苯甲酸钠的阴性样品溶液（C），以及阳性检出样品溶液（D），在1.2 仪器工作条件下分别进样测定，记录色谱图见图1。由图1 可知，阴性样品对苯甲酸、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯的测定无干扰，理论塔板数按苯甲酸峰计算应不低于9 000，各色谱峰的分离度均大于1.5。

图1 4 种溶液的色谱图

2.4 标准工作曲线方程及检出限

分别精密吸取对照品系列混合工作溶液，在1.2仪器工作条件下测定，以进样质量（x）为横坐标，相对应的色谱峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，以3 倍信噪比为检出限。6 种防腐剂的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表4。由表4 可知，6 种防腐剂在各自的质量范围内与色谱峰面积具有良好的线性关系，相关系数均大于0.999，检出限分别为0.002 7～0.042 0 μg／g。

表4 线性范围、线性方程、相关系数及检出限

2.5 精密度试验

取适量对照品混合溶液，在1.2 色谱条件下连续进样6 次，试验结果见表5。由表5 可知，6 种防腐剂测定结果的相对标准偏差为0.25%～0.82%，表明该方法的精密度良好。

表5 精密度试验结果

2.6 稳定性试验

取适量供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12、16、20、24 h 测定，进样体积为10 μL，连续考察24 h，记录各成分的色谱峰面积，试验结果见表6。由表6可知，测定结果的相对标准偏差为0.64%～1.33%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

表6 稳定性试验结果

2.7 重复性试验

精密吸取2 mL 桔贝合剂样品溶液（批号为180909）于50 mL 容量瓶中，共吸取6 份，分别用50%甲醇溶解并稀释至标线，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，在1.2 仪器工作条件下测定。试验结果显示，山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯均未检出，苯甲酸的平均含量为2.512 6 mg／g，测定结果的相对标准偏差为0.15%（n=6），结果表明该方法的重复性良好。

2.8 加标回收试验

精密称取49.28 mg 苯甲酸、12.65 mg 山梨酸钾、10.86 mg 对羟基苯甲酸甲酯、11.18 mg 对羟基苯甲酸乙酯、10.55 mg 对羟基苯甲酸丙酯和11.23 mg对羟基苯甲酸丁酯，置于同一20 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至标线，作为待加混合对照品溶液。精密量取已知含量的样品1 mL 于50 mL 容量瓶中，制备6 份，分别加入上述待加混合对照品溶液各1 mL，用50%甲醇溶解并稀释至标线，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液在1.2 仪器工作条件下测定，试验结果见表7。由表7 可知，加标样品的平均回收率均大于96.9%（RSD ＜2.0%），表明该方法具有较高的准确度，满足分析要求。

表7 加标回收试验结果

2.9 样品测定

取10 个不同批号的桔贝合剂样品，按照1.3.2方法将每批样品平行制备3 份，在1.2 仪器工作条件下进行测定，以外标法分别计算各防腐剂的含量，测定结果见表8。由表8可知，10 个不同批号的桔贝合剂样品中有一批样品中添加有对羟基苯甲酸乙酯但含量远远低于限量要求，苯甲酸的含量也在限度范围内，整体质量评价较好。

表8 样品含量测定结果 mg／mL

3 结语

建立了超高效液相色谱法测定桔贝合剂中苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯的方法。所建方法操作简单且分析速度快，可快速筛查桔贝合剂中防腐剂的含量，为评价桔贝合剂的安全性提供依据。