张馨予，王勇，尧雪洲，杨彦斌

（1.云南中医药大学第一附属医院肺病科，云南昆明650021；2.首都医科大学附属北京朝阳医院肿瘤科，北京100020；3.云南中医药大学科研实验中心，云南昆明650500；4.云南省中医医院肺病科，云南昆明650021）

非小细胞肺癌是一类发生于肺部的恶性肿瘤，约占原发性肺癌总数的80%左右[1]。现有研究认为，细胞外基质的降解在非小细胞肺癌的发生、发展、侵袭与转移过程中起着至关重要的作用，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）便是其中重要的一类细胞外基质降解酶[2-3]。MMPs能够降解参与信号传导的细胞外基质中的多种成分，在恶性肿瘤中呈高表达，可破坏低于肿瘤细胞的组织屏障，在恶性肿瘤的浸润转移等病理生理过程中具有重要的影响作用[4-5]。目前，MMPs 家族已分离鉴别出20 余种以上，但在临床研究中，以MMP1（matrix metalloproteinase 1，MMP1）最 为 常见，研究发现许多恶性肿瘤细胞的MMP1表达增多，且表达水平会随着肿瘤的分期分级增加而上升[6-7]。由此可见，研究MMP1表达水平与恶性肿瘤的相关性，对指导临床治疗与肿瘤药物研发具有重要意义。目前，非小细胞肺癌已进入精准治疗时代，根据基因表达情况选择科学有效的靶向治疗药物是当下的研究重点。但目前对于MMP1基因异常表达在非小细胞肺癌中的研究成果较少，为此，本文应用生物信息学方法，采用Oncomine 肿瘤芯片数据库及癌细胞系百科全书（Cancer Cell LineEncyclopedia，CCLE）、Kaplan Meier Plotter 在线分析数据库来探究MMP1在非小细胞肺癌细胞与正常细胞中的表达差异，以及MMP1与患者预后的相关性，以期能为此类疾病的预后分析与靶向肿瘤药物研发提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件

研究采用Oncomine v4.5 肿瘤芯片数据库、CCLE 在线分析数据、Kaplan Meier Plotter 在线分析数据库分析MMP1在非小细胞肺癌中的表达情况。

1.2 研究方法

Oncomine v4.5 数据库资料的挖掘、筛选条件设定：（1）基因（gene）：基质金属蛋白酶1（MMP1）；（2）数据类型（data type）：mRNA；（3）分析类型（differential analysis）：癌症vs.正常分析（cancer vs.normal Analysis）；（4）阈值（Threshold）：PVALUE=0.001，倍数变化（fold change）=2，基因排名（gene rank）=top10%。Kaplan Meier Plotter 在线分析数据库资料的挖掘、筛选条件设定：（1）癌症类型（cancer）：肺癌（lung cancer）；（2）基因符号（affy id/gene symbol）：MMP1；（3）组织学分类（histology）：腺癌（adenocarcinoma）或鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma)；（4）Cox回归（Cox regression）：多元（multivariate）。

1.3 统计学方法

Oncomine 数据库收集MMP1 在不同肿瘤中的表达指标，筛选近20 年有关非小细胞肺癌中MMP1表达的研究，分析比较MMP1 在肺癌细胞组织与正常细胞组织中的表达差异；利用CCLE 在线数据库分析MMP1基因在不同癌细胞系（40 类）的表达情况；并采用Kaplan Meier Plotter 在线数据库进行非小细胞癌患者的生存分析，以评价MMP1表达水平与患者预后的相关性。

2 结果

2.1 不同肿瘤中MMP1的表达结果分析

本次研究中，从Oncomine 数据库中共收集到有关MMP1在多种类型肿瘤中表达水平的研究338项，其中有统计学差异（P＜0.05）的研究结果共有62项，包括MMP1表达水平升高61 项，MMP1表达水平下降1项。见图1所示：

2.2 MMP1在肺癌中的表达分析

图1 不同肿瘤中MMP1的表达结果Figure 1 Expression of MMP1 in different tumors

通过对Oncomine 数据库中近20 年（2001-2020）肺癌研究结果的筛选，结果发现共有8个项目参与了MMP1在非小细胞肺癌（包括肺腺癌、鳞状细胞肺癌）细胞组织与正常细胞组织中表达水平的研究，结果显示MMP1在肺癌细胞中呈高表达，与正常细胞相比差异有统计学意义（P均＜0.05），见表1。通过对这8 项研究的Meta 分析，显示MMP1基因表达 差 异 中 位 数 数 值 为469.5，P值 为1.20×10-4，见图2。

2.3 MMP1在肺癌细胞和正常细胞中的差异分析

提取Oncomine数据库8项肺癌分析的MMP1表达数据，利用GraphPad Prism 5 软件制作散点图比较MMP1在肺癌细胞和正常细胞中的差异，8 项研究均显示肺癌细胞中MMP1表达水平明显高于正常细胞（P＜0.05），见图3。

2.4 MMP1在不同癌组织细胞中的表达分析

利用CCLE 在线数据库分析MMP1基因在不同癌细胞系（40类）的表达情况，结果显示，MMP1在非小细胞肺癌中的表达值排名第23 位，处于中间位置，提示MMP1在非小细胞肺癌中有着比较高的表达，见图4所示。

表1 8项肺癌分析的MMP1表达水平比较Table 1 Comparison of MMP1 expression levels in 8 lung cancer analysis

图2 8项肺癌分析的MMP1表达水平比较Figure 2 Comparison of MMP1 expression levels in 8 lung cancer analysis

2.5 MMP1表达水平与非小细胞肺癌患者预后相关性分析

利用Kaplan Meier Plotter 在线数据库进一步分析了MMP1表达水平与患者预后的相关性，结果显示MMP1表达水平对肺腺癌患者预后有显著影响HR=1.53（1.21～1.94）（P=0.000 34）；但MMP1表达水平对鳞状细胞肺癌患者预后无显著影响HR=0.91（0.72～1.15）（P=0.43）。见图5示。

3 讨论

非小细胞肺癌发病率在我国一直居高不下，约占原发性肺癌总数的80%左右[1]，其中大多数患者确诊时就已处于中晚期，治疗难度大，且疗效较差。近年来随着医学技术的长足发展以及基因靶向药物的出现，使得非小细胞肺癌患者的治疗及预后得到了明显的改善，但患者的实际获益仍远远低于预期[8-9]。为进一步提高肺癌患者的治疗效果及预后，医学界一直十分关注肺癌相关的分子生物学技术研究，经过不断的努力现已陆续发现ALK[10]、PD-L1[11-12]、PD-1[13]、ROS-1[14]、MMPs[15-17]等 肺 癌 驱 动基因或免疫治疗靶点，针对这些靶点研发肿瘤分子靶向药物，极大地提高了肺癌患者的治疗效果及生存质量。

图3 MMP1在肺癌细胞和正常细胞中的差异分析Figure 3 Differential analysis of MMP1 in lung cancer cells and normal cells

图4 MMP1在不同癌组织细胞中的表达排行Figure 4 Expression of MMP1 in different cancer tissues

图5 MMP1表达与非小细胞肺癌患者预后相关性Figure 5 Correlation between MMP1 expression and prognosis of patients with NSCLC

目前MMPs家族分离鉴别出的成员共有26 个，将其依次编号为MMP1～MMP26。这些MMPs家庭成员又根据其作用底物及片断同源性的差异分为6大类，包括：明胶酶、胶原酶、基质溶解素、基质降解素、furin 活化的MMP、其他分泌型MMP。其中，MMP1 作为MMPs的家族成员之一，归为胶原酶一类，其在肺癌[18]、胃癌[19]、食管鳞癌[20]、人骨肉瘤[21]等多种恶性肿瘤细胞中呈高表达。MMP1的主要作用底物为纤维性胶原，其能通过降解细胞外基质中的胶原纤维和明胶及改变细胞中的微环境，影响恶性肿瘤的侵袭与转移能力，作用于肿瘤发生的初始阶段时会促使肿瘤的形成[22]。但目前医学界对于MMP1的研究还局限于临床病例分析，鲜有研究对MMP1表达水平进行多种癌症类型、多种亚型以及多样本资料的科学统计分析。

本研究试着通过几个收录有庞大癌基因信息的在线数据库，分析不同肺癌研究中MMP1的表达差异。其中，Oncomine 数据库是目前世界上最大的癌基因芯片数据库和整合数据挖掘平台，拥有最全的癌症突变谱、基因表达数据以及相关的临床信息，可用于发现新的生物标记物或新的治疗靶点[23]。本次研究通过对Oncomine 数据库MMP1与非小细胞肺癌相关数据信息的统计发现，MMP1在非小细胞肺癌组织中的表达明显增多，与正常细胞组织比较有明显差异。临床相关研究也发现，鳞状细胞肺癌中MMP1的表达水平较正常细胞明显升高，认为其可能参与了鳞状细胞肺癌的侵袭与转移[24]。MMP1是一类Zn2+依赖的细胞外蛋白水解酶，可以降解Ⅰ型胶原与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型纤维胶原[25]。在肺恶性肿瘤细胞中产生的MMP1，经由旁分泌作用于癌基质，从而引起了肿瘤的侵袭与转移。因此认为，MMP1是非小细胞肺癌的重要分子标记物。

美国Broad 研究所、Dana-Farber 癌症研究所和Novartis 生物医学研究所的多个课题组于2012 年合作完成了“癌细胞系百科全书”（CCLE）计划，对覆盖30多种组织来源的947种人类癌细胞系进行了大规模深度测序，整合了DNA 突变、基因表达和染色体拷贝数等遗传信息[26]。本研究采用CCLE 在线分析数据库，进一步分析了MMP1基因在不同癌细胞系（40类）的表达情况，结果显示，MMP1在非小细胞肺癌中有着较高的表达，表达值排名第23 位，这一结果与Oncomine 数据库研究结果也比较相符，提示MMP1检测在非小细胞肺癌的疗效及预后评估中有着一定的应用价值。Kaplan Meier plotter 在线数据库主要用作恶性肿瘤的生存分析，该数据库包含5万多个与恶性肿瘤患者预后相关的基因信息。本研究通过Kaplan Meier plotter 数据库了解MMP1与非小细胞肺癌患者预后的相关性，结果显示，MMP1表达水平对肺腺癌患者预后有显著影响，但对鳞状细胞肺癌患者预后无显著影响，提示MMP1检测对肺腺部患者预后评估有重要意义。

综上所述，MMP1在非小细胞癌中的表达增多，与正常细胞中的表达水平比较有明显差异；此外，MMP1表达水平与肺腺癌患者的预后存在显著相关性，可以作为非小细胞肺癌恶性程度的标志物之一。研究为肿瘤分子靶向药物研发及临床科学治疗提供了理论依据。