杨旭辉，吴远菲，梁嘉颖，陈柳青

（广东省妇幼保健院生殖健康与不孕症科，广东广州510080）

透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种长链的多糖结构, 主要分布在肺、肾及生殖系统的疏松结缔组织，与透明质酸结合蛋白(hyalur onic acid binding protein,HABP)特异性结合后与细胞外基质结合发挥作用，提高细胞外结构稳定。其对卵母细胞、精子生理活动及受精过程也发挥重要的作用。HA 主要以受体HABP-配体的方式与人、兔、牛精子结合,促进精子获能、精子活力、受精能力及顶体反应。啮齿类、牛及人成熟后期的精子表面已发现透明质酸结合蛋白，而且至少2 个特异的能与透明质酸结合的蛋白位点，使精子能够与卵细胞透明带结合，从而实现穿透与受精[1-4]。不成熟的精子头部缺乏HA 受体,不具备与HA 结合的能力。Gabor 等[5]证明能与HA 结合的精子成熟度高,已完成质膜重构、胞质膨出、核组蛋白与鱼精蛋白的置换等一系列过程,形成膜外HA 结合位点;若成熟过程障碍则可导致精子头部HA 结合位点的缺失[6],影响精卵识别而导致受精障碍。由此可见HA 精子代表一群成熟度高、各项功能完备的精子群。王金香等[7]研究显示,精子-透明质酸结合率＜65%时,总受精率和正常受精率均显著降低, 建议即使精液常规参数正常, 也应谨慎选择体外受精(IVF)。Ye 等[8]研究表明, 精子-透明质酸结合率与精子的前向运动率和正常形态率高度相关, 可进一步反映精液质量。牟万宏等[9]证实，精子-透明质酸结合率≥65%的原因不明性不孕患者的人工授精周期妊娠率高于精子-透明质酸结合率＜65%的患者，提示使用与HA 结合的精子实施人工授精能获得更好的结局。

精子-透明质酸结合试验(hyaluronan binding assay,HBA)作为一种简便易行的评估活动精子成熟度的功能检测方法,但其独立或联合其他指标对于受精能力、胚胎发育潜能及流产的预测却仍存在争议。本研究通过比较HBA 正常组和HBA 异常组间的精液各项参数以及受精、胚胎发育及妊娠结局,探寻HBA 独立或联合其他指标对IVF 受精、胚胎发育及结局的预测价值,从而更好地指导临床。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

WLJY-9000型计算机辅助精子质量分析仪(CASA)购自北京伟力；HBA、DNA 碎片检测试剂盒均购自深圳市博锐德生物科技有限公司；精子形态diff-quick 快速染色试剂购自广州展成生物科技有限公司。

1.2 标本来源及分组

2017 年1 月-12 月在广东省妇幼保健院生殖中心取卵行IVF-ET 的患者，纳入标准：①排除卵子未成熟或异常导致的受精失败；②排除女方卵巢低反应;③精液常规检查示前向运动(progressive motility,PR)精子总数≥15×106,正常形态率＞1%。依照WHO技术规范采集、处理和检测精液标本。完全液化后分别检测常规精液参数、DNA 碎片、形态和以固相HA 法检测透明质酸结合率。按照透明质酸临界值58%将患者分为A 组(＜58%)和B 组(≥58%)。本研究经医院伦理委员会批准,且患者知情同意。

1.3 研究方法

1.3.1 HBA、精液常规、正常精子形态率、DNA 碎片率分析 115 份新鲜精液标本，以CASA 检测精液常规，HBA（精子-透明质酸结合率）按试剂盒说明书检测，在包被有透明质酸的载玻片上加入液化的精液10 μL，盖上盖玻片，20～30 ℃条件下反应10 min，显微镜20×10 观察并计数500 条活动精子，记录精子尾部持续鞭打但头部被结合至玻片表面活动受限(与透明质酸结合)的精子数量，计算HBA 率。HBA(%)=100%×与透明质酸结合精子数/计数的活动精子总数,分析HBA 结果与精子密度的相关性；以Diff-Quik 染色法染色，按照WHO 形态学判断标准检测精子正常形态率。精子核染色质扩散法检测每份标本的精子DNA 碎片水平:将含10×106/mL精子的易熔凝胶覆盖在包被有固态凝胶的载玻片上，经变性、脱核、脱水、染色处理后，显微镜下观察计数500 条精子，计算存在DNA 碎片的精子百分率。精子DNA 碎片率(%)=100%×存在DNA 碎片精子数/计数的精子总数。

1.3.2 IVF-ET 过程GnRH-a 长方案和拮抗剂方案GnRH-a 长方案：黄体中期，皮下注射促性腺激素释放激素激动剂醋酸曲普瑞林（达菲林）1.25 mg 行垂体降调节，约14 d 左右达到降调标准后[内膜厚度＜5 mm、E2＜50 pg/mL，FSH(卵泡刺激素）和LH均＜5 U/L]，根据患者年龄、AFC（窦卵泡数）、bFSH 和黄体生成素(LH)值决定肌注果纳芬/丽申宝/HMG 的起始剂量，根据卵泡生长情况及E2+孕酮+LH 水平调整用药。当卵泡直径≥18 mm时，当晚肌注人绒毛膜促性腺激素HCG4 000～10 000 IU，34～36 h后取卵。精卵共孵育16～18 h，观察受精情况(仅2PN 是正常受精)，正常受精率=正常受精卵子数/体外受精的总卵子数，受精率=总受精卵子数/体外受精的总卵子数。再次培养48 h 后，观察胚胎细胞数及碎片比例并评估胚胎质量，选取优质胚胎在B超引导下进行移植。优质胚胎率=大于等于6 细胞优质胚胎个数/正常受精卵源的胚胎总数，可用胚胎率=大于4细胞胚胎个数/正常受精卵源的胚胎总数。拮抗剂方案：月经第2～3 天测量性激素并评估卵巢基础状态，进周促排。促排期间，监测阴道B 超及性激素。在卵泡直径增长至12 mm 以上时，加用GnRH 拮抗剂。待卵泡直径大于18 mm 时予以绒促性素扳机，夜针后36 h取卵。

1.3.3 血清激素测定 月经周期第2～4 天抽取空腹外周静脉血3～4 mL 平衡至室温后3 000 r/min 分离血清，电化学发光法测定FSH、LH和E2。

1.3.4 AFC 计数 月经周期第2～4 天二维超声观察双侧卵巢位置、形态，记录直径为1～5 mm 的AFC 数(重复测量2～3次)。

1.3.5 统计学方法 采用SPSS16.0 统计软件。各组计量资料先行正态分布检验，组间计量资料比较采用非参数Mann-Whitney 检验(非正态)；相关性分析采用spearman(非正态)分析；利用ROC 曲线及二分类logistic回归分析评价各指标的预测价值。

2 结果

2.1 精液常规、正常形态率、精子DNA 碎片率和透明质酸结合率等相关参数的正态分布检验

用SPSS16.0 软件分别对各组年龄、FSH、AMH（苗勒氏激素）、AFC 计数资料进行正态分布检验，显示大部分为非正态分布。

2.2 HBA 与精子密度、正常形态率和DNA 碎片率的关系

分别比较两组精子常规、正常形态率和DNA 碎片率。结果显示，两组精子密度、DNA 碎片率和正常形态率差异均无统计学意义（Z=-0.741，P=0.459；Z=-0.306，P=0.760；Z=-0.589，P=0.556），见表1。分别对HBA、精子密度、正常形态率和DNA碎片率进行相关性分析，结果发现仅碎片与透明质酸结合率负相关（r=-0.198，P=0.034），密度与正常形态率显著正相关（r=0.394，P=0.000）。

2.3 IVF-ET女方的基本情况

共纳入正常受精的IVF组115例,两组男方和女方的年龄、不孕年限、BMI、移植胚胎数等比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

2.4 受精及胚胎情况

共纳入正常受精的IVF组115例,两组受精率和正常受精率、卵裂率、正常卵裂率、优质胚胎率和可利用胚胎率差异均无统计学意义（P＞0.05）(表3)。针对透明质酸和受精及胚胎发育进行相关性分析发现与正常受精率正相关（r=0.204，P=0.029）

表1 两组精子密度、正常形态率和DNA碎片率的比较Table 1 Levels of the sperm density,normal morphology rate and DNA fragmentation rate between two groups

表2 IVF-ET患者基本情况Table 2 Basic situation of patients in IVF-ET

表3 IVF-ET患者受精及胚胎发育情况比较Table 3 Fertilization and embryo development of patients in IVF-ET between two groups

2.5 与妊娠结局的相关性分析

HBA、DNA 碎片、正常形态率、密度和男方年龄预测临床妊娠的ROC 曲线下面积AUC1、AUC2、AUC3、AUC4、AUC5分别为0.512、0.435、0.494、0.488、0.335。仅透明质酸结合实验AUC大于机会参考线下面积(P＜0.05)，但是预测效果并不显著（图1），经过logistic 回归分析，求得HBA、DNA 碎片和男方年龄的log(P)值，log(P)=4.000-0.099×男方年龄-0.001×透明质酸-0.001×DNA 碎片。针对该值进行早期流产的联合预测，求得ROC 曲线下面积为0.661，预测价值较为显著，其中log(P)的预测临界值0.485 4，灵敏度83.1%，特异度54.0%，见图2。

2.6 早期流产的预测

HBA、DNA碎片、正常形态率、密度、男方年龄预测早期流产的ROC 曲线下面积AUC1、AUC2、AUC3、AUC4、AUC5分 别 为0.482、0.580、0.592，0.610、0.725。除了透明质酸各指标的AUC均大于机会参考线下面积(P＜0.05)，但是预测效果并不显著，见图3。经过logistic 回归分析，求得HBA、DNA 碎片和男方年龄的log(P)值，log(P)=-7.011+0.134×男方年龄+0.008×透明质酸+0.022×DNA 碎片。针对该值做早期流产的联合预测，求得ROC 曲线下面积为0.730，预测价值较为显著，其中log(P)的预测临界值0.294 9，灵敏度66.7%，特异度24.5%。

图1 透明质酸结合实验，DNA 碎片率、正常形态率、密度和男方年龄预测临床妊娠的ROC曲线分析Figure 1 ROC curves of HBA,DNA fragmentation rate,normal morphology rate, density and male age in predicting clinical pregnant rate in IVF-ET

图2 HBA、DNA 碎片率和男方年龄联合预测临床妊娠的ROC曲线分析Figure 2 ROC curves of HBA and DNA fragmentation rate combined with male age in predicting clinical pregnant rate in IVF-ET

图3 透明质酸结合实验，DNA 碎片率、正常形态率、密度和男方年龄预测临床早期流产的ROC曲线分析Figure 3 ROC curves of HBA, DNA fragmentation rate, normal morphology rate, density and male age in predicting clinical early abortion rate in IVF-ET

图4 透明质酸结合实验，DNA 碎片率和男方年龄联合预测临床早期流产的ROC曲线分析Figure 4 ROC curves of HBA, DNA fragmentation rate combined with male age in predicting clinical early abortion rate in IVF-ET

3 讨论

辅助生殖技术的发展，对配子的功能检测要求越来越高，传统的检测方法如常规、形态、抗精子抗体等准确反映精子受精能力有限，精子受精功能相关检测相当复杂，受限于实验材料的获取、实验条件的精准控制以及结果是否准确反映在体功能，例如诱发顶体反应、精卵透明带结合实验等。因此，目前的功能检测更偏向于寻找一些反映精子某项功能的相关标记物，通过检测标记物来间接反映精子某项功能。

透明质酸是人卵母细胞和透明带黏液基质的主要成分，精子在成熟的后期可获得与透明质酸特异性结合的能力，并且精子至少产生2 个特异的能与透明质酸结合的蛋白位点，使精子能够与卵细胞透明带结合，从而实现穿透与受精。透明质酸结合实验就是在体外模拟这一过程，从而实现精子头部透明质酸受体的鉴定和量化，间接反映精子成熟度，是精子质量评估的新方法。这一新方法是否优于传统精液常规形态等检测指标，是否具有预测受精、胚胎发育及妊娠结局的潜能是本研究关注的问题。

本研究分两部分，一部分体外检测HBA，对具有透明质酸受体精子的密度、正常形态率和DNA 碎片进行了检测与比对。研究结果未发现精液标本透明质酸结合率与精子正常形态率和密度的相关性，但是与碎片呈较强的负相关性。

精子形态是评价精子质量的常规指标之一，也是影响受精的重要环节。Prinosilova 等[10]研究证实可与透明质酸结合的精子，其正常形态率比原始精液精子提高了3.04 倍(95%CI:1.9-4.7)。刘瑜等[11]也持同样的观点，本研究未发现HBA 与精子正常形态率的相关性，可能有3 个因素：（1）是否受所选取的样本总体有关。（2）透明质酸结合实验结果准确性受实验过程的约束，在时间的把握上有些难，稍微迟一点观察，本来已经黏附的精子就已经游离变成阴性了，使得研究结果很难做到质控和统一。（3）这个指标单一作为筛选优质精子的特异性和敏感性还有待于进一步商榷。也有研究[12]证实HA 结合精子的形态超高倍放大后并不具有优势，可能与评估标准不同有关。环境中的活性氧、精子生成过程中染色体的异常组装、凋亡均可造成精子DNA 损伤，降低精子受精能力和胚胎发育潜能，从而降低妊娠率，使流产率增高。本研究显示：精子DNA 碎片与具有透明质酸的精子负相关,提示具有透明质酸结合位点的精子凋亡率较低。HA 与精子发育过程中的细胞凋亡、DNA 碎片化、非整倍体染色体形成以及成熟度等相关性广为报道。有学者发现，能被透明质酸结合的精子，其DNA 损伤率、核蛋白苯胺蓝着色率明显低于同一原始精液标本[13],从不同角度验证了有透明质酸受体精子成熟度更好，更易耐受氧化损伤等不良刺激。

本研究进一步收集了115 例患者行IVF-ET 周期，纳入研究的两组女方平均年龄、平均不孕年限、总Gn 用量、平均Gn 使用时间等组间差异均无统计学意义。研究检测了男方精液的透明质酸结合率，将患者分为结合率正常组和结合率非正常组，比较两组的受精率、正常受精率、卵裂率、正常卵裂率、优质胚胎率、可利用胚胎和临床妊娠率是否有差异，同时将透明质酸结合率与上述指标进行相关性分析，结果并未发现两组有显著性差异，但是相关性分析发现透明质酸结合率与正常受精率正相关。由于受到精子和卵子来源的制约很难大规模推广，HBA是用来替代精-卵透明带结合试验的检测方法,是用来评估精子结合透明带的能力，其结果与常规IVF 受精结局之间的相关性,仍存在争议。之前的研究文献[14-15]多通过比较精子-透明质酸结合率与受精率之间的相关性来证明其对于受精能力的预测价值。王金香等[7]研究显示, 精子-透明质酸结合率＜65%时, 总受精率和正常受精率均显著降低(P＜0.01)。Ye 等[8]对175 例常规IVF 周期样本研究发现HBA 结合率与体外受精率显著相关。而Nijs等[14]研究结果显示HBA 与受精率并无相关性，但发现HBA 与妊娠率显著相关。本研究发现其与正常受精率的相关性，证实HBA 结合精子相对受精率高。本研究也发现HBA 与胚胎质量如优质胚胎率和可利用胚胎率之间无相关性，HBA 预测胚胎发育潜能、妊娠和流产的价值也不高，只能与其他反映成熟度的指标连用才具有相对较好的预测价值。与一些研究[15-16]结果一致，Tarozzi 等[15]研究报道HBA 与体外受精率及临床妊娠率均无相关性。Boynukalin 等[16]研究结果提示HBA 结合率并不能提示临床妊娠率。HBA 对妊娠和早期流产的单一指标的预测价值很有限，但是HBA 联合男方年龄、DNA 碎片可以将预测妊娠的概率提高到66.1%。联合男方年龄和DNA 碎片率对早期流产就有较强的预测价值（75%），与刘瑜等[17]的报道类似，刘瑜等的研究结果显示HBA 联合DNA 碎片率可提高对早期流产的预测。

综上所述，头部具有透明质酸结合位点的精子，其DNA 完整性更好；HBA 联合其他指标可有效预测妊娠和流产，但作为单一指标对妊娠及流产的预测价值有限。作为检测精子透明质酸受体的HBA，可能是评价精子多重质量的潜在指标。