黄重铭，彭慧婷，林晓彤，曹洋

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405）

在全球范围内，肺癌仍是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。肺癌的主要临床表现为咳嗽、血痰、胸闷胸痛、气促、发热等[2]。由于症状缺乏特异性，常与呼吸系统的症状相似，患者多不重视，因此确诊时往往已失去根治性手术切除的机会[3]。目前肺癌的治疗以手术、放化疗、靶向治疗、免疫治疗为主，可并发骨髓抑制、神经毒性、肝肾功能损害、皮疹、间质性肺炎等不良反应，整体治疗效果仍不理想[2,4]。随着研究的不断深入，中医药在治疗肺癌方面逐渐显示出独特的优势。研究表明，中医药在抑制肺癌的增殖和转移，改善放化疗及靶向治疗的毒副作用，提高患者的生存质量，延长生存期等方面发挥重要作用[5]。

猫爪草是毛茛科植物小毛茛（Ranunculus ternatusThunb.）的干燥块根，广泛分布于河南、安徽、浙江、江苏等地。猫爪草的药用历史较短，最早收录于《中药材手册》，1977 年起正式载入《中华人民共和国药典》[6]。其味甘、辛，性温，归肝、肺经，具有化痰消肿、解毒散结的功效。现代药理学研究表明，猫爪草具有抗肿瘤、调节免疫活性、抗氧化、抗感染等药理作用[7]，是治疗肺癌的常用药物之一。李穗晖[8]等采用仙鱼汤（由仙鹤草、鱼腥草、猫爪草、山海螺、天冬、山慈菇、浙贝母、莱菔子、守宫、枳壳、党参等组成）治疗中晚期原发性支气管肺癌，结果显示治疗后免疫功能改善。申刚磊[9]等通过电子病历系统提取和分析某三甲中医院1 175 张治疗肺癌的有效处方，中药频次统计提示猫爪草是排名前10的高频药物。但由于中药治疗肿瘤具有“多成分-多靶点-多通路”的特点，猫爪草治疗肺癌的作用机制尚不明确。

近年兴起的网络药理学基于系统生物学理论，综合药物、靶点与疾病之间的复杂网络关系，用于分析和预测药物的作用机制[10-11]。本研究运用网络药理学的方法，筛选猫爪草治疗肺癌的活性成分和关键靶点，并对猫爪草治疗肺癌的作用机制进行预测和分析，既为猫爪草的临床应用提供一定理论依据，也为对其更深入的研究提供思路和借鉴。

1 材料与方法

1.1 猫爪草活性成分的筛选

采用TCMSP 数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）检索并收集猫爪草的化学成分。选取符合筛选条件OB≥30%，DL≥0.18 的化学成分作为潜在活性成分。查阅相关文献资料，收集具有抗癌活性但因不符合筛选条件而被删除的化学成分。

1.2 猫爪草活性成分作用靶点的收集

将“1.1”项下筛选获得的猫爪草潜在活性成分，通过Pubchem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索其化学结构，并保存为Smiles 格式。将上述文件分别导入Swiss target prediction 平台（http://swisstargetprediction.ch/），获取活性成分作用靶点及靶点类型归属。

1.3 疾病靶点的收集与“活性成分-靶点”网络的构建

使 用DisGeNET 数 据 库（http://www.disgenet.org/）和OMIM 数据库（https://omim.org/）收集肺癌相关靶点并去重合并。使用uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/）分别对药物潜在活性成分靶点和疾病靶点进行标准化。利用Draw venn diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）对活性成分靶点和疾病靶点进行匹配映射，获取共同靶点，并绘制韦恩图。采用Cytoscape3.7.0 构建“活性成分-靶点”网络，分析活性成分和靶点网络，并筛选潜在关键活性成分。

1.4 蛋白互作（PPI）网络的构建

将共同靶点导入String 数据库（https://string-db.org/），限定研究物种为人类，将最低相互作用分值设置为“higest confident 0.9”，获取高置信度的PPI网络关系。将分析结果导入Cytoscape3.7.0 进行可视化与网络拓扑分析。自由度（degree）反映网络中与该节点直接相互作用的节点的数目。自由度越高，节点在网络中的作用越重要。根据自由度对关键靶点进行筛选。

1.5 分子对接验证

从TCMSP 数据库中查询“1.3”项下筛选获得的关键活性成分，并保存为mol2格式。使用Openbabel 2.4.1 将活性成分的靶点转换为sdf 格式。在PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）中查询并下载核心靶点的3D 结构。使用AutoDockTools 对靶点蛋白进行加氢、去水等预处理。运行AutoDockTools 对活性成分和靶点蛋白进行对接，以最低结合能作为分子对接的结果。结合相关文献，结合能＜0 提示活性成分与靶点蛋白能发生自发结合，结合能≤5 提示有较强的结合能力[12]。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）是一个集成生物知识库和分析工具的数据库，能够系统地从给定的基因或蛋白质列表中分析生物学意义[13]。将共同靶点上传至DAVID 数据库，GO 分析时选择生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）3 个模块进行功能注释，通路分析选择KEGG 模块。将分析结果分别编排至Excel 文件中，以P＜0.01 对结果进行筛选并按照显著程度由高到低排序。使用Omic-Share 平台（https://www.omicshare.com/）将排名前20的KEGG分析结果以气泡图的形式展现。

2 结果

2.1 猫爪草的活性成分

通过检索TCMSP 数据库，共收集到猫爪草的化学成分79 种。按OB≥30%、DL≥0.18 标准进一步筛选，得到猫爪草潜在活性成分12种。查阅相关文献发现，棕榈酸（palmitic acid）的OB 值和DL 值虽然不满足筛选条件，但已被证实具有较好抗癌活性，是猫爪草抗肿瘤的主要化学成分之一，因此将该化学成分也纳入其中，最终获得猫爪草潜在活性成分13种，见表1。

2.2 靶点收集与基因映射

通过Swiss target prediction 平台对猫爪草潜在活性成分作用靶点进行预测，共得到预测靶点294个，并通过Uniprot 标准化。使用DisGeNET 数据库和OMIM（https://omim.org/）数据库收集肺癌相关靶点，分别获得肺癌相关靶点2 449 个和200 个，去重合并后导入uniprot 标准化，最终获取肺癌靶点2 303个。将猫爪草294个活性成分靶点和2 303个肺癌靶点进行匹配映射并绘制韦恩图，见图1。获取共同靶点121 个，这些靶点是猫爪草活性成分治疗肺癌的潜在靶点。

2.3 “活性成分-靶点”网络构建与分析

将匹配映射获得的121个潜在靶点及其对应的活性成分信息导入Cytoscape3.7.0，构建“活性成分-靶点”网络，见图2。图2 表明，存在多种成分对应1 个靶点或1 种成分对应多个靶点的现象，体现中药多成分、多靶点协同作用的特点[14]。网络与共同靶点直接相连的猫爪草活性成分有8 种，提示这些化学活性成分具有潜在治疗肺癌作用。网络拓扑分析结果显示，能同时与30个及以上靶点相连的活性成分（degree 值≥30）有3 种，包括7-O-甲基毛纲草酚（7-O-methyleriodictyol）（degree=50），邻苯二甲酸正辛酯（truflex OBP）（degree=44）和棕榈酸（palmitic acid）（degree=30），可能是猫爪草治疗肺癌的关键活性成分。

表1 猫爪草活性成分Table 1 Active components of Ranunculi Ternati Radix

图1 猫爪草活性成分作用靶点与肺癌相关靶点交集映射图Figure 1 Intersection map of targets of active components of Ranunculi Ternati Radix and lung cancer related targets

2.4 PPI网络的构建与分析

通过String 数据库得到蛋白互作网络关系，并使用Cytoscape3.7.0 对PPI 网络进行可视化，见图3。图中共包含90 个节点，277 条连线。以节点的大小和颜色的深浅反映degree 值的大小。节点越大、颜色越深，对应的degree值越大，则该节点在网络中的地位越重要。经计算得网络平均degree 值为6.16，以大于平均degree 值的2 倍为条件对PPI 网络进行二次筛选[15]，最终获得7 个关键靶点，见表2。这些关键靶点可能在猫爪草治疗肺癌中发挥重要作用，其蛋白类型以激酶为主。

2.5 分子对接验证

将筛选得到的7 个关键靶点与3 种关键活性成分进行分子对接，见表3。由表3 可知，每1 个靶点蛋白至少可与1种关键活性成分较好结合，3种活性成分均能与大部分关键靶点较好结合。结果表明，猫爪草的活性成分可以对核心靶点发挥调控作用。

2.6 GO功能富集分析

GO 分析获得P＜0.01 的条目共56 条，其中生物过程（BP）相关条目33 条，主要涉及转录、凋亡过程的负调控、ERK1 和ERK2 级联的正调节、细胞增殖调控、细胞周期阻滞的负调控、蛋白质自磷酸化等方面；细胞组分（CC）相关条目9 条，主要富集在细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、细胞表面、细胞质、质膜、胞浆等。分子功能（MF）相关条目14 条，主要富集在类固醇激素受体、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子活性、配体激活序列特异性DNA 结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、药物结合等。按照显著程度排列对生物过程、细胞组分、分子功能的部分条目信息进行展示，见表4。

2.7 KEGG通路富集分析

图2 猫爪草活性成分和交集靶点网络关系的构建Figure 2 Construction of network relationship between active components of Ranunculi Ternati Radix and intersection targets

图3 猫爪草治疗肺癌相关靶点PPI网络图Figure 3 PPI network of related targets in the treatment of lung cancer with Ranunculi Ternati Radix

根据P＜0.01 共筛选出62 条KEGG 通路。按照显著程度选取排名前20位的通路进行分析，并通过Omicshare 平台进行可视化，见图4。结合相关文献，推测猫爪草活性成分靶点可能通过作用于缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号转导通路、抑癌基因p53 信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路这4条通路发挥治疗肺癌的作用。由于PI3K-Akt 通路是HIF-1、p53、VEGF 等通路的上游信号通路，且PI3K-Akt 通路富集了较多的猫爪草作用靶点，因此推测PI3K-Akt 信号通路是猫爪草治疗肺癌的关键通路。见图5。

3 讨论

本研究共收集猫爪草相关活性成分共13 种。研究表明，棕榈酸是猫爪草抗肿瘤的主要活性成分之一，能够通过诱导细胞凋亡，抑制人肺癌A549 细胞株的增殖。药代动力学研究表明，棕榈酸静脉注射后具有明显的肺组织靶向性，在肺组织的浓度显著高于其他组织中的药物浓度[16]。此外，7-O-甲基毛纲草酚和邻苯二甲酸正辛酯在“活性成分-靶点”网络中同属于关键活性成分，但目前相关研究较少，可为抗癌中药单体的研发提供新线索和研究方向。

肺癌的发生与多种驱动基因密切相关，这些驱动基因同时也是药物作用的靶点[2]。表皮生长因子受体（EGFR）和磷脂酰肌醇-3-激酶（PIK3CA）是PPI网络的关键靶点。EGFR 是肺腺癌常见驱动基因，其突变可导致酪氨酸激酶异常持续活化，造成细胞不受控生长而发生癌变，目前表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）治疗EGFR 敏感突变已经取得良好的效果[17]。分子对接结果表明，EGFR与猫爪草多种关键成分有较好的结合活性。猫爪草能否在EGFR-TKIs 靶向治疗中起协同增效作用、能否对EGFR 的表达与突变起一定的抑制作用，进而抑制肺癌的进展，值得进一步研究。PIK3CA 作为肺鳞癌较常见的驱动基因[18]，其扩增可以激活PI3K-AKT 信号通路，导致细胞过度增殖，增强细胞侵袭和转移能力[19-20]，由于PIK3CA 激活突变对PI3K通路抑制剂最为敏感，因此PIK3CA 有望成为肺鳞癌治疗的新靶点[18]。

表2 猫爪草治疗肺癌关键靶点信息Table 2 Key target information of Ranunculi Ternati Radix in the treatment of lung cancer

表3 猫爪草关键靶点与关键活性成分的分子对接结果Table 3 Molecular docking results of Ranunculi Ternati Radix′s key targets and key active components

表4 GO功能富集分析结果Table 4 Results of GO functional enrichment analysis

图4 KEGG功能富集分析结果（前20）Figure 4 Results of KEGG functional enrichment analysis（top 20）

图5 猫爪草活性成分在PI3K-Akt信号通路的标注图Figure 5 Annotated drawing of the active components of Ranunculi Ternati Radix in the PI3K-Akt signaling pathway

GO 分析发现猫爪草作用靶点参与转录、凋亡过程的负调控、细胞增殖调控、细胞周期阻滞的负调控、蛋白质自磷酸化等多种生物学过程，这些过程均与肿瘤的发生发展关系密切[21]。KEGG 分析表明，PI3K/AKT 通路是猫爪草治疗肺癌的关键通路，是促进细胞存活、增殖、抗凋亡、促血管生成、化疗耐受的重要途径[22]。研究表明，PI3K/AKT 通路可通过促进血管内皮生长因子(VEGF)和缺氧诱导因子(HIF)的表达，促进肿瘤新生血管生成，进而促进肺癌转移[23-25]；还可下调p53 的表达，进而阻断凋亡信号通路的传递，诱导肺癌耐药[22]。结合图5可见，猫爪草作用靶点广泛分布在PI3K/AKT 通路的上游、核心和下游等部分，因此推测猫爪草可以通过调控PI3K/AKT通路的相关靶点，发挥抗肿瘤作用。

本研究通过网络药理学方法，对猫爪草治疗肺癌作用机制进行研究，发现猫爪草可能通过抑制以PI3K-Akt 信号通路为主的多条肺癌相关途径，发挥抑制增殖、促进凋亡、抑制血管生成等作用。猫爪草治疗肺癌的作用机制符合中药多成分、多靶点、多通路的特点，后续研究将进一步对筛选出来的关键靶点和通路进行实验验证，从分子生物学层面明确猫爪草抑制肺癌的调控机制，为猫爪草的临床应用提供理论依据。