玉屏风颗粒对HaCaT 特应性皮炎细胞模型的保护作用研究

2021-04-30郑柳怡谢凯枫杨九妹黄丹娥陈玉兴

广东药科大学学报 2021年2期

郑柳怡，谢凯枫，杨九妹，黄丹娥，陈玉兴

(1.广州中医药大学第五临床医学院，广东广州510405；2.广东省第二中医院/广东省中医药工程技术研究院，广东广州510095；3.广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州510095)

特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)是常见的慢性炎症皮肤病，表皮屏障破坏以及炎症反应是该疾病发生发展的关键因素[1]。体内高水平的组胺和炎性细胞因子等可引起瘙痒、红斑和尖锐丘疹等症状[2]。AD 是一个世界性的健康问题，流行病学显示高收入国家已有20%的儿童和10%的成年人患有此病，且呈持续增长趋势，严重者会影响睡眠，引发压力或焦虑等[3]。AD 治疗多采用皮质类固醇，但长期使用会导致皮肤萎缩、潮红、多毛、毛细血管扩张、痤疮等严重的副作用[4]。

玉屏风颗粒源于《究原方》的玉屏风散[5]，由黄芪、白术和防风三味药组成，是益气固表止汗的经典方剂。已有研究报道玉屏风颗粒在临床上具有治疗特应性皮炎的效果。马荣双发现对婴儿期特应性皮炎进行治疗时使用玉屏风颗粒可减少湿疹面积并改善患儿的免疫水平，安全性更高[6]；与单独使用抗组胺药物西替利嗪相比，玉屏风颗粒联合西替利嗪治疗特应性皮炎更能有效改善患者受损皮肤状态，且复发率更低[7]。张丽等[8]通过网络药理学研究发现玉屏风散可能通过炎症反应和细胞增殖来发挥治疗特异性皮炎的作用。然而关于玉屏风颗粒治疗特应性皮炎的机制研究，未见报道。故基于已有的研究，本次实验通过利用组胺和聚肌胞苷酸分别诱导HaCaT 细胞建立特应性皮炎细胞模型，从细胞学角度初步探讨玉屏风颗粒对HaCaT 细胞建立特应性皮炎细胞模型细胞炎症因子表达的影响，为玉屏风颗粒在临床上的应用提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 细胞株

HaCaT 人永生化角质形成细胞，广州吉妮欧生物技术有限公司产品。

1.2 药品与主要试剂

玉屏风颗粒(YPFKL,国药集团广东环球制药有限公司，批号170103)；氯雷他定对照品(中国药品生物制品检定院，批号100615-200602，质量分数99.8%)：聚肌胞苷酸(Sigma，批号BCBC3546A)；组胺(Sigma，批号BCBC2083V)；二甲基亚砜(DMSO,Sangon Biotech，批号F514BA0010)；DMEM 高糖培养基ZQ-100(上海中桥新舟生物科技有限公司，批号20191018)；Penicillin-Streptomycin 双抗(Corning, 批号30002321)；0.25%胰酶(Gibco, 批号2085264)；总RNA 提取剂(北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司,批号99G00127)。

1.3 主要仪器

CO2细胞培养箱(美国Thermo 公司)；Cellometer Mini自动细胞计数仪(美国Nexcelom 公司)；DMI8倒置荧光显微镜(德国Leica 公司)；6321Y602022 型普通PCR 仪器(Eppendorf 公司)；C1000 型荧光定量PCR 仪器(Bio-Rad 公司)；Varioskan Flash 型全波长多功能酶标仪(美国Thermo公司)。

2 方法

2.1 人类角质形成细胞HaCaT细胞的培养

HaCaT 细胞采用含10%（φ）胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM 培养基，放入37 ℃、5%（φ）CO2细胞培养箱中培养，常规换液及传代培养，正常情况下细胞贴壁生长。

2.2 MTT 法检测YPFKL 对正常HaCaT 细胞生长的影响

取处于对数期且生长良好的HaCaT 细胞悬液，调整密度为1×104个/孔，接种于含10%胎牛血清、1%双抗DMEM 高糖培养基的96 孔板中，培育24 h后，更换新鲜培养基，各组YPFKL 按100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/L 的质量浓度溶解于DMSO 中，各浓度设置4个复孔，药物分别加入各组细胞中，另外设置不加药的空白组。作用24 h后,弃去培养基，加入30 μL MTT 溶液(3 mg/mL)，6 h 后，将MTT 溶液吸出，加入150 μL DMSO，震摇15 min 后，用酶联免疫检测仪在570 nm 下检测每组吸光度，以空白组细胞吸光值为参考，各组细胞吸光值所占百分比即为细胞存活率。

2.3 MTT 法检测YPFKL 对histamine 诱导下的Ha-CaT细胞生长的影响

取处于对数期且生长良好的HaCaT 细胞悬液，调整密度为1×104个/孔，接种于含10%胎牛血清、1%双抗DMEM 高糖培养基的96 孔板中，细胞分为空白组、模型组和药物干预组。培育12 h 后，除空白组外，其余各组加入histamine 40 μmol/mL 诱导HaCaT 细胞。继续培育24 h 后，药物干预组按“2.2”方法的浓度分别加入各组细胞中，作用24 h 后同“2.2”法进行MTT检测。

2.4 MTT 法检测YPFKL 对Poly(I:C)诱导下的HaCaT细胞生长的影响

取处于对数期且生长良好的HaCaT 细胞悬液，调整密度为1×104个/孔，接种于含10%胎牛血清、1%双抗DMEM 高糖培养基的96 孔板中，细胞分为空白组、模型组和药物干预组。培育12 h 后，除空白组外，其余各组加入Poly(I:C) 25 μg/mL 诱导HaCaT 细胞。继续培育24 h 后，药物干预组按“2.2”方法的浓度分别加入各组细胞中，作用24 h 后同“2.2”法进行MTT检测。

2.5 荧光定量PCR 法检测YPFKL 对histamine 诱导下的HaCaT 细胞相关炎性细胞因子的mRNA 水平的影响

HaCaT 细胞接种于含10%胎牛血清、1%双抗DMEM 高糖培养基的6 孔板中，接种密度为1×105个/孔，于37 ℃、5%CO2培养箱静置培养24 h 后，除空白组外，其余各孔加入histamine 40 μmol/mL 诱导HaCaT细胞，药物干预组加入氯雷他定(100 μmol/L)，YPFKL 高(50 μg/L)、中(25 μg/L)、低浓度(12.5 μg/L)组，24 h 后实验结束，PBS 洗细胞2 次，用Trizol 法提取总RNA 为模板设计特异性引物由Pubmed-NCBI提供基因序列，引物设计使用Primer-Blast，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各引物序列见表1。

2.6 荧光定量PCR 法检测YPFKL 对Poly(I:C) 诱导下的HaCaT 细胞相关炎性细胞因子的mRNA 水平的影响

HaCaT 细胞接种于含10%胎牛血清、1%双抗DMEM 高糖培养基的6 孔板中，接种密度为1×105个/孔，于37 ℃、5% CO2培养箱静置培养24 h 后，除空白组外，其余各孔加入Poly(I:C) 25 μg/mL 诱导HaCaT细胞，药物干预组加入氯雷他定(100 μmol/L)，YPFKL 高(50 μg/L)、中(25 μg/L)、低浓度(12.5 μg/L)组，24 h 实验结束后操作同“2.5”方法进行荧光定量PCR操作，检测基因见表1。

2.7 统计学方法

采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行多组间比较；组间均数两两比较，方差齐时采用SNK法；方差不齐时采用Dunnett’s T3法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

表1 扩增的基因引物信息Table 1 Primer information of amplified genes

3 结果

3.1 MTT 法检测YPFKL 对正常HaCaT 细胞生长的影响

与空白组比较，质量浓度50、25、12.5 μg/L 的YPFKL 显著提高细胞存活率(P＜0.01,P＜0.05)，质量浓度6.25、3.125 μg/L 的YPFKL 对细胞存活率无显著性影响，提示6.25 μg/L及以下浓度YPFKL对细胞生长无影响，100 μg/L YPFKL 组细胞存活率显著降低(P＜0.01)，提示该浓度对细胞有毒性作用，见表2。

3.2 MTT法检测YPFKL对histamine诱导下的HaCaT细胞生长的影响

与模型组比较，质量浓度为50、25、12.5、6.25 μg/L的YPFKL 均能显著提高HaCaT 细胞的存活率(P＜0.01)，见表3。

3.3 MTT 法检测YPFKL 对Poly(I:C)诱导下的HaCaT细胞生长的影响

与模型组比较，质量浓度为50、25 μg/L YPFKL均能显著提高HaCaT 细胞的存活率(P＜0.01)，见表4。

表2 不同浓度YPFKL对正常HaCaT细胞存活率的影响Table 2 Effects of different concentrations of YPFKL on the survival rate of normal HaCaT(，n=4)

与空白组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

组别空白组YPFKL1 YPFKL2 YPFKL3 YPFKL4 YPFKL5 YPFKL6剂量/(μg·L-1)-100 50 25 12.5 6.25 3.125存活率/%100.00±8.58 77.54±4.96**167.68±10.15**130.64±19.97*119.78±5.51**94.65±9.71 87.54±7.99

表3 不同浓度YPFKL对histamine诱导下的HaCaT细胞存活率的影响(，n=4)Table 3 Effects of different concentrations of YPFKL on the survival rate of HaCaT cells induced by histamine

与空白组比较：**P＜0.01；与模型组比较：##P＜0.01。

组别空白组模型组YPFKL1 YPFKL2 YPFKL3 YPFKL4 YPFKL5剂量/(μg·L-1)--5 0 25 12.5 6.25 3.125存活率/%100.00±2.44 66.64±3.63**84.38±3.64##78.73±1.70##78.54±2.17##71.98±2.59##64.85±5.12

表4 不同浓度YPFKL对Poly(I:C)诱导下的HaCaT细胞存活率的影响(，n=4)Table 4 Effects of different concentrations of YPFKL on the survival rate of HaCaT cells induced by Poly(I:C)

与空白组比较：**P＜0.01；与模型组比较：##P＜0.01。

组别正常组模型组YPFKL1 YPFKL2 YPFKL3 YPFKL4 YPFKL5剂量/(μg·L-1)--5 0 25 12.5 6.25 3.125存活率/%100.00±7.50 63.39±2.94**89.45±6.72##80.74±3.82##72.22±4.19 64.87±4.54 66.08±8.05

3.4 YPFKL 对histamine 诱导下的HaCaT 细胞中相关炎症因子的mRNA水平的影响

与模型组相比，YPFKL 高浓度组HaCaT 细胞IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1 的mRNA 表达水平显著性降低(P＜0.01,P＜0.05)，YPFKL 中浓度组HaCaT 细胞IL-1β和TNF-α mRNA 表达水平显著性下降(P＜0.01，P＜0.05)，见表5。

表5 YPFKL对histamine诱导下的HaCaT细胞炎症因子mRNA表达水平的影响Table 5 Effect of YPFKL on the mRNA expression of inflammatory factors in HaCaT cells induced by histamine (，n=3)

与空白组比较：*P＜0.05,**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05,##P＜0.01。

组别空白组模型组氯雷他定组（μmol·mL-1）YPFKL高浓度组中浓度组低浓度组剂量/(μg·L-1)100 50 25 12.5 IL-1β 1.00±0.20 1.93±0.14**1.34±0.07##1.49±0.14#1.52±0.23#1.80±0.15 IL-6 1.00±0.40 1.88±0.34**1.02±0.04##1.12±0.08#1.33±0.22 1.72±0.18 IL-8 1.00±0.30 1.82±0.21**1.36±0.11 1.15±0.18##1.60±0.12 1.83±0.21 TNF-α 1.00±0.07 1.82±0.17**1.26±0.14##1.14±0.17##1.36±0.12##1.59±0.23 MCP-1 1.00±0.12 1.84±0.06*1.05±0.08##1.15±0.09##1.46±0.27 1.70±0.14

3.5 YPFKL 对Poly(I:C)诱导下的HaCaT 细胞中相关炎症因子mRNA表达水平的影响

与模型组相比，YPFKL 高浓度组IL-1β、IL-8、TNF-α 和MCP-1 的mRNA 表达水平显著性下降(P＜0.01，P＜0.05)，YPFKL 中浓度组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 的mRNA 表达水平显著性降低(P＜0.05)，YPFKL 低浓度组MCP-1 的mRNA 表达水平显著性降低(P＜0.01)，见表6。

4 讨论

特应性皮炎属于过敏性炎症疾病，临床根据症状表现以及过敏源将特应性皮炎分为单纯型和混合型，混合型通常伴随呼吸系统疾病的发生，如哮喘和过敏性鼻炎，患者常见皮肤出现丘疹红斑，或因抓挠而出现溃烂等现象[7]。其发病机制复杂，多与皮肤屏障破坏，肥大细胞释放炎症因子引起的机体炎症水平升高相关[8]。当人体接触过敏原时，表皮细胞释放促炎细胞因子或趋化因子等炎症介质，并能产生具有生物活性的白细胞介素-8(IL-8)，IL-8可介导T细胞和中性粒细胞进入表皮参与免疫炎症反应[9]。肥大细胞也是与过敏性炎症反应相关的主要效应细胞。当抗原与抗体结合后，肥大细胞开始脱颗粒，释放组胺等生物活性物质，还产生各种促炎因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β和IL-6以及趋化因子[10]。这些介质通过募集和激活免疫细胞进一步促进炎症反应。其中IL-1β是表皮屏障被破坏后由角质形成细胞释放的细胞因子，它可以激活树突状细胞分泌细胞因子使Th细胞分化失衡，导致皮肤屏障受损[11]。单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)在过敏性疾病中起正调节作用, 它参与早期炎症反应,可促进大量以组胺为主的炎症介质释放[12]。TNF-α是一种多向性的促炎因子，可以诱导淋巴细胞释放大量细胞因子，并能显著促进胸腺基质淋巴生成素的释放，破坏表皮形态及屏障功能[13]。IL-6、TNF-α、IL-4 以及MCP-1 已成为AD 患者的重要判断指标，其体内水平与AD病情呈正相关关系[14]。

玉屏风颗粒来源于扶正固表的经典名方玉屏风散，该方君以黄芪，性甘温而内补脾肺之气，外能止汗固表；臣以白术能健脾益气，加强君药益气固表之功；防风为佐可散风邪。三药合用，可奏固表不留邪，驱邪不伤正气之效[15]。玉屏风颗粒在临床上具有广泛的应用且疗效显著。临床研究发现，婴儿期特应性皮炎使用玉屏风颗粒治疗可以有效减少湿疹面积，且复发率较低[6]。较单独运用氯雷他定相比，玉屏风颗粒联合氯雷他定，能够更显著改善过敏性皮炎患者的临床体征，获得更好的临床疗效[16]。

已有研究使用组胺或Poly(I:C)诱导人永生化角质形成细胞产生AD 状态的病理细胞模型[17-18]。故本实验在其基础上使用HaCaT 细胞构建特应性皮炎细胞模型研究玉屏风颗粒治疗该病的可能机制。在本次研究中，质量浓度为100 μg/L 的玉屏风颗粒显著抑制HaCaT 细胞的存活率，说明该浓度对细胞具有杀伤作用；6.25 μg/L 及以下浓度的玉屏风颗粒对细胞存活率无显著影响，50、25、12.5 μg/L 可以显著提高细胞的存活率，且细胞的存活率随着浓度的升高而提高，可猜测玉屏风颗粒在50 ～12.5 μg/L 浓度范围内可有效促进HaCaT 细胞增殖，对细胞具有保护作用。当使用组胺诱导HaCaT 细胞成为特异性皮炎细胞之后，50、25、12.5 以及6.25 μg/L 浓度的玉屏风颗粒均可以显著提高HaCaT 细胞的存活率，且50 和25 μg/L 浓度玉屏风颗粒能不同程度抑制相关炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1mRNA的表达，其中50 μg/L浓度的玉屏风颗粒促进细胞增殖且抑制炎症因子表达的效果最好；当使用Poly(I:C)诱导HaCaT 细胞成为特异性皮炎细胞之后，亦能发现50、25 μg/L浓度玉屏风颗粒显著提高细胞存活率，50、25、12.5 μg/L 浓度玉屏风颗粒均能够不同程度抑制相关炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1mRNA 的表达，且发现玉屏风颗粒促进细胞增殖并抑制炎症因子表达的能力随着浓度的升高而加强。

表6 YPFKL对Poly(I:C)诱导下的HaCaT细胞炎症因子mRNA表达水平表达的影响Table 6 Effect of YPFKL on the mRNA expression of inflammatory factors in HaCaT cells induced by Poly(I:C)(，n=3)

与空白组比较：*P＜0.05,**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05,##P＜0.01。

组别空白组模型组氯雷他定组（μmol·mL-1）YPFKL高浓度组中浓度组低浓度组剂量/(μg·L-1)100 50 25 12.5 IL-1β 1.00±0.11 1.96±0.18**1.14±0.26##1.14±0.23##1.47±0.06#1.62±0.25 IL-6 1.00±0.69 1.79±0.06*0.84±0.08#1.39±0.17 1.50±0.04#1.56±0.07 IL-8 1.00±0.07 1.77±0.04**1.15±0.17##0.99±0.17##1.43±0.24#1.65±0.14 TNF-α 1.00±0.16 1.79±0.04**1.11±0.09##1.31±0.17#1.37±0.09#1.53±0.28 MCP-1 1.00±0.09 1.79±0.10**1.11±0.07##1.27±0.03##1.52±0.23 0.91±0.06##

综上所述，玉屏风颗粒可能通过促进角质形成细胞的增殖并抑制细胞炎症因子的表达来保护皮肤细胞，从而达到修复受损皮肤屏障，缓解皮肤炎症反应的作用。该实验仅从体外实验去阐述玉屏风颗粒治疗特应性皮炎的可能机制，下一步将开展动物体内实验进一步发现玉屏风颗粒治疗特应性皮炎的机制。