吴林生 徐德聪

摘要 以蓝莓为原料，研究不同因素对蓝莓酵素发酵的影响，以确定最优发酵工艺参数。研究红糖添加量、发酵温度、发酵时间以及添加酵母菌种类4个因素对蓝莓酵素发酵液的影响，并记录发酵液pH的变化，对发酵产品的色泽、气味及滋味进行感官评价，并以超氧化物歧化酶（SOD）活性、DPPH自由基清除能力为理化检测指标进行分析，最终确定蓝莓酵素发酵的最优工艺参数。蓝莓酵素发酵加工的最优工艺参数如下：蓝莓酵素发酵液的pH为4.5，蓝莓与红糖质量比为1∶1，发酵温度为25 ℃，发酵时间为28 d，添加葡萄酒酵母时超氧化物歧化酶活性最高，DPPH自由基清除能力最强，感官评分最高。

关键词 蓝莓;酵素;超氧化物歧化酶;DPPH自由基

中图分类号 TS255.4文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）07-0184-04

Abstract Taking blueberry as raw materials，the effects of different factors on the fermentation of blueberry enzymes were studied，the optimal fermentation process parameters were determined.The effects of four factors，namely the amount of brown sugar added，the fermentation temperature，the fermentation time and the addition of yeast strains，on the fermentation broth of  blueberry enzymes were studied，the pH changes of the fermentation broth were recorded.The sensory evaluation was made on the color，odor and taste of the fermentation products.The superoxide dismutase （SOD） activity and scavenging capacity of DPPH free radicals were used as physical and chemical indices for analysis.Finally，the optimum technology parameters for the fermentation of blueberry enzymes were determined.The research results showed that the optimum processing technology parameters for the fermentation of blueberry enzymes were as follows：pH of the blueberry enzyme fermentation broth was 45，the mass ratio of blueberry and brown sugar was 1∶1，the fermentation temperature was 25 ℃，the fermentation time was 28 days， wine yeast was added.Under the above processing technology parameters，SOD activity was the highest，DPPH free radical scavenging capacity was the strongest，the sensory score was the  best.

Key words Blueberry;Enzyme;Superoxide dismutase;DPPH free radicals

作者簡介 吴林生（1984—），女，安徽合肥人，实验员，从事农产品加工与贮藏研究。

蓝莓为越橘属植物，原产地为美国佛罗里达州，也称为蓝浆果，成熟后的果实接近圆形或者扁圆形，呈现蓝紫色，外皮有一层白色果粉[1]。蓝莓鲜果皮薄多汁、水分含量非常高，有“浆果之王”之称，富含维生素、果酸和矿物质等营养物质，还富含花青素以及原花青素等多酚类化合物与多糖类化合物，具有抗氧化、抗癌和抗炎作用，对慢性疾病（如糖尿病、肥胖症以及骨质疏松等）有益[2-3]，所以被国际粮农组织称为人类五大健康食品之一[4]。因此，近些年越来越多的人开始关注蓝莓以及与蓝莓相关的产品，也有越来越多的人开始种植蓝莓。

酵素是一种近年来在日本以及中国台湾地区非常流行的功能性食品。酵素主要是果蔬和可食用的药材经过可食用菌种在一定的条件下发酵而成的对人体有益的食用品[5]，这些食用品经过益生菌发酵形成的各种代谢产物能够有效调理以及促进人体肠胃的消化吸收、增强人体的免疫力[6]。人体适当摄取酵素可以延缓机体的衰老，也可以延长人们的寿命[7]。酵素（enzyme）是指酵素菌在活动中产生的各种活性物质和酶，也统称为酶。因其由天然酵素菌产生，无任何副作用等优点，酵素深受人民群众尤其是女性群体的喜爱[8-9]。

日本在20世纪80年代就已经掌握熟练相关的生产技术来制备酵素产品，岛本觉也家族研制复合了24种有益菌，用于生产酵素及其各种衍生产品，其他国家（包括中国在内）都没有研究出超过10种的复合菌种[10]。国外酵素的应用相对中国而言更加广泛，发展水平也更高，在医疗、保健等领域更具代表性。从食品、保健角度来看，以芦荟为例，国外研制出各式各样的芦荟发酵饮品以及保健产品，而国内对芦荟的使用主要集中在芦荟本身的状态上。从医疗保健角度来看，在国外酵素已被用于病毒类疾病、关节炎、癌症、三高症等疾病的治疗，而国内对芦荟产品的研究尚处于初步研究阶段。随着酵素越来越被人们关注，国内外各大酵素公司的竞争也越来越激烈[11-12]。

作为近些年食品行业发展及关注的焦点，转基因食品安全问题存在很大争议，酵素的出现极大地促进了食品及相关行业的发展，酵素食品及其相关产品很可能成为保健食品行业让人追捧的对象之一[13]。

近些年，蓝莓及其加工出来的各种衍生产品越来越受到人们的欢迎，如蓝莓酒、蓝莓醋、蓝莓酸奶等。蓝莓食用酵素作为一种新型的功能产品，能够对人体的健康产生积极、有益的影响。笔者充分利用蓝莓和酵素的高营养价值，研究蓝莓食用酵素的加工工艺并对其进行优化，探讨制备高营养价值的蓝莓酵素产品的加工及优化工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料。

蓝莓、红糖、面包酵母（食品级）。

1.1.2 试剂。无水乙醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸、邻苯三酚，均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程[14-15]。工艺流程如图1所示。

1.2.2 蓝莓酵素最优发酵工艺条件试验设计。

蓝莓常温解冻，红糖紫外灭菌45 min，蓝莓按比例与红糖混合密封装罐，并用标签标记。以超氧化物歧化酶（SOD）活性、DPPH自由基清除能力为检测指标，在其他条件不变的情况下，分别考察蓝莓与红糖质量比、发酵温度、发酵时间、酵母菌种类对蓝莓发酵液试验结果的影响。具体水平的设置根据试验结果可做适当变动。蓝莓与红糖质量比分别设置为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，发酵温度25 ℃，发酵时间35 d，不添加酵母菌进行发酵。

1.2.2.1 发酵温度对蓝莓发酵液的影响：发酵温度分别设置21、23、25、27、29 ℃，蓝莓与红糖质量比为1∶1，发酵时间35 d，不添加酵母菌进行发酵。

1.2.2.2

发酵时间对蓝莓发酵液的影响。发酵时间分别设置7、14、21、28、35、42 d，蓝莓与红糖质量比为1∶1、发酵温度25 ℃，不添加酵母菌进行发酵。

1.2.2.3 酵母菌种类对蓝莓发酵液的影响。分别不用酵母和用葡萄酒酵母（1 g）、面包酵母（1 g）发酵，蓝莓与红糖质量比为1∶1，发酵温度25 ℃，发酵时间35 d进行发酵[16]。

1.2.3 蓝莓酵素发酵液pH测定。每隔7 d取一定量的发酵液置于烧杯中，用精密pH计测定发酵液的pH，并记录数据。

1.2.4 发酵液DPPH自由基清除能力的测定。每隔7 d取1 mL发酵液，稀释30倍，过滤，取滤液待用。

用移液管量取0.02 mg/mL的DPPH-乙醇溶液8  mL置于試管中，加入8  mL样品，摇晃混匀，在25 ℃恒温水浴锅中水浴30 min，测定溶液在517 nm波长处的吸光度。空白组用无

水乙醇代替测定溶液，测定吸光度。按照以下公式计算DPPH自由基清除率（%）：

DPPH自由基清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%

式中，A1为样品溶液的吸光度，A2为用无水乙醇代替DPPH时测得对应浓度的本底吸光度，A0为空白组的吸光度。

1.2.5 发酵液超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定。

1.2.5.1 邻苯三酚自氧化速率的测定。

用移液管量取0.1 mol/L Tris-HCl 4.5 mL 缓冲液置于试管中，加入去离子水4.2 mL，置于25 ℃水浴锅中预热20 min，加入0.3 mL经25 ℃预热的邻苯三酚，快速摇晃混匀，开始计时，空白管为10 mmol/L HCl溶液，在420 nm波长下自反应30 s，以30 s为一次间隔，测定吸光度，总测定时长为4 min。

1.2.5.2 样品酶活性的测定。每隔7 d取1  mL发酵液，稀释30倍后过滤，取滤液待用。

用移液管量取0.1 mol/L Tris-HCl 4.5 mL 缓冲液置于试管中，加入去离子水3.9 mL 、发酵液0.3 mL，置于25 ℃水浴锅中预热20 min，加入0.3 mL经25 ℃预热的邻苯三酚，快速摇晃，开始计时，空白管为10 mmol/L HCl溶液，在420 nm波长下自反应30  s，以30 s为1次间隔，测定吸光度，总测定时长为4 min。按照以下公式计算酶活性：

酶活性（U）=[（A-B）/A]/50%×反应总体积×（样品稀释倍数/样液体积）

式中，A为邻苯三酚自氧化速率，B为发酵液抑制邻苯三酚自氧化速率[17-20]。

1.2.6 蓝莓酵素发酵液的感官评价。

将试验所得的蓝莓酵素发酵液进行色泽、气味及滋味感官评价，并记录评分。感官评价由10位身体健康的实验室小组成员根据表1进行评分，每项取10人评分的平均值，最后综合取色泽、气味和滋味的平均值，平均分取整数。

2 结果与分析

2.1 蓝莓酵素发酵液pH的变化

每隔7 d取一定量的蓝莓与红糖（质量比为1∶1），发酵温度25 ℃，不添加酵母菌发酵的蓝莓酵素发酵液置于烧杯中，用校准过的精密pH计测定发酵液的pH，结果如图2所示。

从图2可以看出，蓝莓酵素发酵液的pH在开始14 d变化较大，pH由6.3变为4.4，此后趋于缓和，pH基本在4.5上下浮动，可见蓝莓酵素在发酵初期发酵速度较快，14 d后发酵速度趋于缓慢。pH的下降可能是由于有机酸浓度在发酵过程中有所增加，pH的升高可能是由于蛋白质被微生物水解以及氨基酸被利用所致。

2.2 不同因素对蓝莓酵素发酵液的影响

2.2.1 蓝莓与红糖质量比对发酵液DPPH自由基清除率和超氧化物歧化酶活性的影响。将蓝莓与红糖的质量比分别设置为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3，发酵温度25 ℃，发酵时间35 d，不添加酵母菌进行发酵，结果见图3。

从图3可以看出，当蓝莓与红糖质量比为1∶1时，蓝莓酵素发酵液的DPPH自由基清除率最高（95.52%），抗氧化性能最好，加入的红糖量过高时会影响发酵液DPPH自由基清除率。

从图4可以看出，当蓝莓与红糖质量比为1∶1时，蓝莓酵素发酵液的超氧化物歧化酶活性最高，达到68.71 U/mL，此后随着红糖量的增加，超氧化物歧化酶活性有所降低。因此，蓝莓酵素发酵液的蓝莓与红糖的最佳质量比为1∶1。

2.2.2 发酵温度对发酵液DPPH自由基清除率和超氧化物歧化酶活性的影响。

将发酵温度分别设置为21、23、25、27、29 ℃，蓝莓与红糖质量比为1∶1，发酵时间35 d，不添加酵母菌进行发酵，结果见图5。

从图5可以看出，蓝莓酵素发酵液发酵初期时随发酵温度的增加，DPPH自由基清除率逐渐升高，当发酵温度为25 ℃时，DPPH自由基清除率达到最高值（95.52%），此后发酵温度的增加抑制了蓝莓酵素的发酵，DPPH自由基清除率逐渐下降。

从图6可以看出，蓝莓酵素发酵液发酵初期时随发酵温度的增加，超氧化物歧化酶活性呈现出上升趋势，当发酵温度为25 ℃时，超氧化物歧化酶活性达到最高值（68.71 U/mL），此后发酵温度的增加抑制了蓝莓酵素的发酵，超氧化物歧化酶活性呈现出下降趋势。因此，蓝莓酵素发酵液的最适发酵温度为25 ℃。

2.2.3 发酵时间对发酵液DPPH自由基清除率和超氧化物歧化酶活性的影响。

发酵时间分别设置7、14、21、28、35、42 d，蓝莓与红糖质量比为1∶1、发酵温度25 ℃，不添加酵母菌进行发酵试验，结果如图7所示。

从图7可以看出，蓝莓酵素发酵液发酵初期随发酵时间的增加，DPPH自由基清除率逐渐升高;当发酵时间达到28 d时DPPH自由基清除率达到最高值（96.79%）;此后，随发酵时间的增加，DPPH自由基清除率逐渐下降。

从图8可以看出，蓝莓酵素发酵液发酵初期时随发酵时间的增加，超氧化物歧化酶活性呈现出上升趋势，当发酵时间为28 d时，超氧化物歧化酶活性达到最高值（69.23 U/mL），此后随发酵时间的增加，超氧化物歧化酶活性呈现出下降趋势。

因此，蓝莓酵素发酵液的最适发酵时间为28 d。

2.2.4 不同酵母菌对发酵液的影响。

分别不用酵母、用葡萄酒酵母（1 g）和面包酵母（1 g）进行发酵，蓝莓与红糖质量比为1∶1，发酵温度25 ℃，发酵时间35 d，结果见表2。

从表2可以看出，添加葡萄酒酵母处理发酵液DPPH自由基清除率最高，添加面包酵母处理次之，不用酵母处理最低;添加葡萄酒酵母处理超氧化物歧化酶活性处理最低，添加面包酵母次之，不用酵母最高。

由此可见，当添加酵母发酵时蓝莓酵素发酵液的DPPH自由基清除率比不添加酵母发酵时高，当添加葡萄酒酵母发酵时DPPH自由基清除率最高，达到97.26%。

当添加酵母发酵时，蓝莓酵素发酵液的超氧化物歧化酶活性比不添加酵母发酵时高，其中当添加葡萄酒酵母发酵时超氧化物歧化酶活性最高，达到70.22 U/mL。因此，蓝莓酵素发酵液可以添加葡萄酒酵母进行发酵。

2.3 蓝莓酵素发酵液的感官评价 将试验所得的蓝莓酵素发酵液进行色泽、气味及滋味感官评价，并记录评分。10位小组成员分别对蓝莓酵素发酵液进行感官评分，平均分数取整数，结果如表3所示。

从表3可以看出，从蓝莓与红糖质量比来看，当蓝莓与红糖质量比为1∶1时平均得分最高（9分），当蓝莓与红糖质量比为3∶1时平均得分最低（5分）;从添加酵母菌种类来看，添加葡萄酒酵母时平均得分最高（10分），而添加葡萄酒酵母和不添加酵母时平均得分均为9分;从发酵温度来看，发酵温度25 ℃时平均得分最高（9分），发酵温度21 ℃时平均得分最低（6分）;从发酵时间来看，发酵时间28 d时平均得分最高（9分），发酵时间7 d时平均得分最低（5分）。由此可见，当蓝莓与红糖质量比为1∶1，添加葡萄酒酵母，发酵温度为25 ℃，发酵时间为28 d时，蓝莓酵素发酵液感官评价的综合评分最高。

3 结论

笔者分别研究了蓝莓与红糖质量比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、发酵温度（21、23、25、27、29 ℃）、发酵时间（7、14、21、28、35、42 d）、添加酵母菌种类（不添加酵母、葡萄酒酵母、面包酵母）4个因素对蓝莓酵素发酵液的影响，并记录发酵液pH的变化，对试验所得发酵产品的色泽、气味及滋味进行感官评价，并结合超氧化物歧化酶（SOD）活性、DPPH自由基清除率為理化检测指标进行分析，最终确定蓝莓酵素发酵的最优工艺参数：发酵液pH最终稳定在4.5左右，当蓝莓与红糖质量比为1∶1、发酵温度为25 ℃、发酵时间为28 d、添加葡萄酒酵母时超氧化物歧化酶活性最高，DPPH自由基清除率最高，感官评分也最高。

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