摘要 [目的]比较加压CO2与热巴氏杀菌对原料乳的杀菌效果。[方法]选择不同的CO2压力、加压时间和温度，研究加压CO2杀菌和热巴氏杀菌对原料乳中天然菌群的杀菌效果。[结果]CO2压力、加压时间、温度对杀菌效果影响显著，且随着压力、温度和时间的增加，杀菌率明显提高。[结论]当CO2压力为7 MPa、温度为4 ℃、处理时间为60 min时，加压CO2杀菌方法杀菌效果最优。

关键词 加压CO2;热巴氏杀菌;杀菌效果

中图分类号 TS252文献标识码 A文章编号 0517-6611（2021）07-0174-03

Abstract [Objective] To compare the bactericidal effect of pressurized CO2 sterilization and hot pasteurization on the natural flora in raw milk. [Method] Different CO2 pressure， pressurization time and temperature were selected. [Result] The results showed that CO2 pressure， time and temperature had significant effects on the bactericidal effect， and the bactericidal rate increased with the increase of pressure， temperature and time. [Conclusion] After sterilized by CO2， the number of bacteria in the raw milk decreased. When the pressure was 7 MPa， the temperature was 4 ℃， and the treatment time was 40 min， the result is optimal.

Key words Pressurized carbon dioxide;Hot pasteurization;Sterilization effect

作者简介 沈培奇（1983—），男，广西南宁人，讲师，硕士，从事食品加工和烹调工艺研究。

对于热敏感性食品，热巴氏杀菌不仅会降低食品的感官品质，还会影响食品的营养品质，因此非热杀菌自提出后逐渐被认可[1]。CO2具有抑菌作用，在10 MPa以下的低压力时，加压CO2杀菌具有较好的杀菌效果[2]。CO2的费用低，来源广泛，容易从产品中分离[3]。目前，有关高密度CO2杀菌技术在微生物杀灭研究方面的报道逐年增多，这充分说明该杀菌技术应用的发展潜力巨大[4-5]。

CO2加压杀菌技术在果汁、肉制品以及固体食品中的研究较多[6-9]，但是对原料乳的研究相对较少，且对单一菌种的研究较多，对于原料乳整体微生物研究较少。笔者比较了加压CO2杀菌和热巴氏杀菌2种方式对原料乳中天然菌群的杀菌效果，旨在为拓展CO2杀菌的应用范围提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 原料乳购于当地牧场、当地农场。 CO2气体，食品级，浓度（V/V）≥99.9，购于当地黎明气体有限公司。

1.2 方法

选择原料乳中最常见的致病菌（金黄色葡萄球菌和肠杆菌科细菌）以及最常见的腐败菌（假单胞菌和乳酸菌）作为目标菌群，采用连续加压方式，时间分别为30、60 min。

1.2.1 不同处理压力对原料乳的杀菌效果。样品1为空白对照，样品2为巴氏杀菌处理（63 ℃ 30 min），样品3、4为室温25 ℃下CO2压力分别为7、9 MPa，连续加压20 min，对处理后樣品中的假单胞菌、肠杆菌科细菌、乳酸菌、金黄色葡萄球菌和细菌总数的杀菌率进行测定。

1.2.1.1 加压CO2 杀菌方法。通入CO2气体，排除空气，加入50 mL悬菌液，通入CO2至一定压力，在保压过程中为了保持菌液的悬浮状态，使用磁力搅样器搅拌。

1.2.1.2 巴氏杀菌处理方法。原料乳的热巴氏杀菌处理在加压设备中进行[10]，关闭CO2气体进气阀，使反应在大气压下进行。水浴温度63 ℃，保持30 min。热巴氏杀菌处理以后，将原料乳样品无菌取出，测定样品中假单胞菌、乳酸菌、肠杆菌科细菌、金黄色葡萄球菌、细菌总数。

1.2.2 不同处理时间对原料乳的杀菌效果。样品1为空白对照，样品2为巴氏杀菌处理（63 ℃ 30 min），样品3、4分别为室温25 ℃ 7 MPa CO2压力，连续加压30、60 min。对处理样品中的假单胞菌、肠杆菌科细菌、乳酸菌、金黄色葡萄球菌和细菌总数的杀菌率进行测定。

1.2.3 不同处理温度对原料乳的杀菌效果。样品1为空白对照，样品2为巴氏杀菌处理（63 ℃ 30 min），样品3、4分别为室温4、25 ℃下7 MPa CO2压力，连续加压60 min。对处理后样品中的假单胞菌、肠杆菌科细菌、乳酸菌、金黄色葡萄球菌和细菌总数的杀菌率进行检测。

1.2.4 各类菌落数的测定。

1.2.4.1 肠杆菌科。琼脂培养基（VRBGA）配比：酵母浸膏3 g，乳糖10 g，蛋白胨7 g，胆盐1.5 g，氯化钠 5 g，中性红0.03 g，结晶紫0.002 g，琼脂15 g，1 000 mL蒸馏水，调节培养基pH为7.3～7.5，灭菌温度121 ℃，时间15 min。细菌30 ℃培养48 h后开始计数。

1.2.4.2 乳酸菌。琼脂培养基（MRS）配比：磷酸氢二钾和柠檬酸铵2 g，蛋白和牛肉膏10 g，酵母浸膏5 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.58 g，葡萄糖20 g，80 mL吐温，琼脂 15 g，碳酸钙20 g和硫酸锰0.25 g，1 000 mL蒸馏水，调节培养基的pH至6.2～6.4，灭菌温度121 ℃、时间15 min。细菌30 ℃培养48 h后开始计数。

1.2.4.3 金黄色葡萄球菌。琼脂培养基（Baird-Parker）配比：将Baird-Parker琼脂培养基加水溶解并分装每瓶95 mL，121 ℃灭菌15 min。将温度冷却至50 ℃，增菌剂卵黄亚碲酸钾预热50 ℃，在培养基中加入增菌剂5 mL，摇匀后倾注平板，备用。培养基致密不透明，使用前在冰箱存放的时间不得超过48 h。细菌30 ℃培养48 h后开始计数[11]。

1.2.4.4 细菌总数。培养条件：PCA培养基，37 ℃ 48 h，培养基配制方法：营养琼脂45 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌15 min。

细菌杀菌率计算公式如下：

杀菌率（%）=N0-NN0×100

式中，N0为处理前细菌数（CFU/mL）;N为处理后细菌存活数（CFU/mL）。

1.2.4.5 假单胞菌的测定。琼脂培养基（CFC）的配制：20 g蛋白胨，1.4 g MgCl2，1.0 g无水硫酸钾，13.6 g琼脂，甘油10 mL，1 000 mL蒸馏水，121 ℃灭菌15 min。细菌的培养温度为25 ℃，在培养基中培养48 h后开始计数。

1.2.5 数据分析。试验数据用Excel软件整理统计，利用SPSS 17.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同压力CO2加压与巴氏杀菌处理的杀菌效果对比

CO2能够快速有效穿透菌体细胞壁[12-13]，该试验应用的压力分别是7、9 MPa。由图1可知，当压力从7 MPa增加至9 MPa时，对所有菌的杀灭能力增大，各种菌总数显著降低（P<0.05）。这与GarciaGonzalez等[14]研究结果一致。通常认为，增强的CO2杀菌作用是由于增加的CO2溶解在细胞外基质中[15-16]，CO2的扩散性会随着溶解性的增加而增加，且菌体细胞膜的完整性发生改变，菌体细胞膜的流动性也会随着溶解性增加而增加。

9 MPa CO2压力处理的样品，假单胞菌菌数降低到2.37 log CFU/mL，高于热巴氏杀菌后的假单胞菌菌数2.29 log CFU/mL（P>0.05）;肠杆菌科细菌菌数是2.46 log CFU/mL，仍然显著高于热巴氏杀菌后的肠杆菌菌数1.10 log CFU/mL（P<0.05）;乳酸菌的菌数是3.45 log CFU/mL，细菌总数是3.96 log CFU/mL，均高于热巴氏杀菌处理的乳酸菌菌数（3.12 log CFU/mL）和细菌总数（3.26 log CFU/mL），但差异均不显著（P>0.05）;热巴氏杀菌后检测不到金黄色葡萄球菌，冷杀菌后能够检出2.17 log CFU/mL。热巴氏杀菌较加压CO2处理能更好地除去金黄色葡萄球菌，与革兰氏阴性菌相比，对于加压CO2处理更加具有抵抗力的是革兰氏阳性菌。此外，CO2压力从7 MPa增加至9 MPa时，细菌总数的变化均不显著（P>0.05）。

2.2 CO2加压处理不同时间与巴氏杀菌处理的杀菌效果对比

从图2可知，加压30 min处理假单胞菌菌数、肠杆菌科细菌菌数、乳酸菌菌数、细菌总数、金黄色葡萄球菌菌数分别降低1.44、1.69、0.60、1.40和1.01 log CFU/mL（P<0.05）。当越来越多的CO2分子进入到微生物细胞时，菌体细胞内pH也会逐渐降低。加压60 min处理后，假单胞菌菌数降低到2.13 log CFU/mL，低于热巴氏杀菌后的假单胞菌菌数282 log CFU/mL（P<0.05）;肠杆菌科细菌菌数是1.34 log CFU/mL，低于熱巴氏杀菌后的肠杆菌细菌的菌数1.49 log CFU/mL（P>0.05）;细菌总数是3.55 log CFU/mL，低于热巴氏杀菌后的细菌总数4.13 log CFU/mL（P>0.05）;但是乳酸菌菌数为3.37 log CFU/mL，仍然高于热巴氏杀菌后的乳酸菌菌数3.23 log CFU/mL（P>0.05）。在牛乳中可以检测到金黄色葡萄球菌的存在。以上结果说明，与热巴氏杀菌相比，加压CO2处理60 min，同样能有效降低样品中的肠杆菌科细菌菌数、假单胞菌菌数和细菌总数。CO2加压处理60、30 min，细菌总数分别为3.55、4.50 log CFU/mL，与热巴氏杀菌相比，差异不显著（P>0.05）。

2.3 不同温度下加压CO2与巴氏杀菌处理的杀菌效果对比

GarciaGonzalez等[13]研究表明，升高温度可以提高杀菌能力。但考虑到实际运输原料乳的需要，选择冷藏温度4 ℃作为加压CO2处理温度。

由图3可知，在4 ℃下，7 MPa连续加压CO2 60 min处理，假单胞菌菌数降低到2.15 log CFU/mL，与热巴氏杀菌（3.03 log CFU/mL）相比，差异显著（P<0.05）;肠杆菌科细菌菌数是1.18 log CFU/mL，显著低于热巴氏杀菌后的肠杆菌细菌菌数1.84 log CFU/mL（P<0.05）;细菌总数是3.65 log CFU/mL，低于热巴氏杀菌后的细菌总数3.81 log CFU/mL（P>0.05）。但是乳酸菌菌数3.04 log CFU/mL高于热巴氏杀菌后的乳酸菌菌数2.93 log CFU/mL（P>0.05）。在该条件下处理后，样品中检测不到金黄色葡萄球菌。

与25 ℃处理相比，4  ℃处理能够更好地杀灭原料乳样品中的天然微生物。在4 ℃下，假单胞菌、肠杆菌科细菌、乳酸菌、细菌总数和金黄色葡萄球菌的菌数分别降低了2.44、269、1.54、2.25和3.39 log CFU/mL。在25 ℃处理后，假单胞菌、肠杆菌科细菌、乳酸菌、细菌总数、金黄色葡萄球菌的菌数分别降低了0.72、1.89、0.13、0.45和1.81 log CFU/mL。在4 ℃时微生物新陈代谢较慢，生长受到抑制。综上，4 ℃处理的杀菌效果优于25 ℃处理以及热巴氏杀菌。

3 结论

加压CO2处理可使原料乳中假单胞菌、肠杆菌科细菌、乳酸菌和金黄色葡萄球菌菌数和细菌总数降低，且CO2压力、加压时间以及温度的改变对杀菌效果影响较大。当压力为7 MPa、温度为4 ℃、时间为60 min时，杀菌效果最佳，原料乳中各细菌数量均下降，且未检测出金黄色葡萄球菌。因此，在对牛乳进行冷藏前，与传统巴氏杀菌相比，加压CO2处

理可使原料乳的保藏期更长，为乳制品的灭菌处理方式提供了更多有效的选择。

参考文献

[1] POSSAS A，PREZRODRGUEZ F，VALERO A，et al.Modelling the inactivation of Listeria monocytogenes by high hydrostatic pressure processing in foods：A review[J].Trends in food science & technology，2017，70：45-55.

[2] PANIAGUAMARTNEZ I，MULET A，GARCAALVARADO M A，et al.Orange juice processing using a continuous flow ultrasoundassisted supercritical CO2，system：Microbiota inactivation and product quality[J].Innovative food science & emerging technologies，2018，47：362-370.

[3] 孙彦琳，苏树朋，韩立英，等.高压CO2与超高压均质协同杀菌装置的研发[J].食品与机械，2017，33（1）：84-86.

[4] FERRENTINO G，PLAZA M L，RAMIREZRODRIGUES M，et al.Effects of dense phase carbon dioxide pasteurization on the physical and quality attributes of a red grapefruit juice [J].Journal of food science，2009，74（6）：E333-E341.

[5] SPILIMBERGO S，CIOLA L.Supercritical CO2 and N2O pasteurisation of peach and kiwi juice [J].International journal of food science & technology，2010，45（8）：1619-1625.

[6] RAO L，BI X F，ZHAO F，et al.Effect of highpressure CO2 processing on bacterial spores[J].Critical reviews in food science and nutrition，2016，56（11）：1808-1825.

[7] PRAMUDITA I E，NOVIANA M L，MULJANA H.Study of pretreatment and enzymatic hydrolysis on microcrystalline cellulose and HVS A4 paper in pressurized CO2 media[J].Modern applied science，2015，9（7）：16-23.

[8] LI H，ZHAO L，WU J H，et al.Inactivation of natural microorganisms in litchi juice by highpressure carbon dioxide combined with mild heat and nisin[J].Food microbiology，2012，30（1）：139-145.

[9] 周先漢，张安，曾庆梅，等.超临界CO2杀灭芽孢工艺条件的优化[J].安徽农业科学，2010，38（17）：9201-9203.

[10] 王桂桢，陈忠泽.巴氏杀菌工艺的改进研究[J].中国乳业，2017（3）：61-65.

[11] 高璇.市售鲜牛奶中金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析[J].安徽农业科学，2018，46（27）：173-175.

[12] AMARAL G V，SILVA E K，CAVALCANTI R N，et al.Dairy processing using supercritical carbon dioxide technology：Theoretical fundamentals，quality and safety aspects[J].Trends in food science & technology，2017，64：94-101.

[13] GARCIAGONZALEZ L，GEERAERD A H，SPILIMBERGO S，et al.High pressure carbon dioxide inactivation of microorganisms in foods：The past，the present and the future [J].International journal of food microbiology，2007，117（1）：1-28.

[14] GARCIAGONZALEZ L，GEERAERD A H，ELST K，et al.Inactivation of naturally occurring microorganisms in liquid whole egg using high pressure carbon dioxide processing as an alternative to heat pasteurization [J].The journal of supercritical fluids，2009，51（1）：74-82.

[15] ILLERA A E，SANZ M T，TRIGUEROS E，et al.Effect of high pressure carbon dioxide on tomato juice：Inactivation kinetics of pectin methylesterase and polygalacturonase and determination of other quality parameters[J].Journal of food engineering，2018，239：64-71.

[16] 祖林林.高压CO2对全蛋液的杀菌效果及机理的初探[D].武汉：华中农业大学，2018.