戴研平 高晓勤

（1 贵州医科大学基础医学院病理学与病理生理学教研室，贵阳 550004；2 遵义医药高等专科学校基础医学院，遵义 563006；3 岳阳市岳阳楼区人民医院，岳阳 414000）

蛋白激酶B（serine/threonine kinase B，AKT）属于丝/苏氨酸激酶，在肿瘤发生中起着重要作用。蛋白激酶B2（AKT2）是AKT家族的重要成员之一，它可以通过PI3K 途径被激活。PI3K/AKT途径能够影响肿瘤的恶性度和预后[1]。RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术能够对靶基因的mRNA 进行高效、特异降解，小干扰RNA 被导入细胞后进而促使靶基因的同源mRNA 被降解，达到高效和特异阻断目的基因的效果[2-4]。附睾功能的异常会影响精子的成熟，导致男性不育。但目前关于基因沉默大鼠附睾组织AKT2 及其与男性生殖系统疾病的研究报道少见。本实验通过大鼠附睾组织AKT2 慢病毒短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）表达载体的构建和病毒的包装，然后将通过验证的高滴度病毒液干扰正常成年大鼠附睾组织后，免疫印迹检测转染后的效果，为后续研究AKT2 基因在男性生殖系统的具体分子机制提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 试剂

PMAGic7.1载体（上海生物工程股份有限公司）；Taq酶和dNTP TaKaRa（DR001B）；T4 DNA ligase（Fermentas）；5×Annealing Buffer for DNA Oligos（碧云天）；AgeI-HF（NEB）；EcoRI-HF NEB（R3101L）；DH5a 感受态细胞；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒；DL2，000 DNA Marker 均购买于TaKaRa公司；AKT2抗体（Gentex公司）。

引物合成、阳性克隆测序由生工生物工程（上海）股份有限公司合作完成。SPF级的健康清洁级成年雄性SD大鼠50只，由贵州医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCK（贵州），2018-0001。

1.2 仪器

DNA 电泳槽DYCP-31DN、稳压电泳仪DYY-5（北京六一仪器厂）；电热恒温水槽DK-8D（上海一恒科学仪器有限公司）；凝胶成像仪Tanon-2500（上海天能科技有限公司）；恒温培养箱GNP-9050（上海精宏实验设备有限公司）；……