熊梦秋，王旭鸿，潘蓓，聂俊杰，王书奎，何帮顺(.南京市第一医院中心实验室，南京0006; .东南大学医学院，南京89)

生长刺激表达基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2,ST2)基因片段大小约为4×104bp,编码556个氨基酸的蛋白质，相对分子质量(Mr)约为63×103。ST2是白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)受体家族成员，具有2种异构体。研究表明，可溶性ST2(soluble ST2,sST2)在介导炎症的过程发挥关键作用，其通过调控网络影响相关细胞因子的表达，特别是在心脏损伤伴随的炎症过程中起着重要作用[1]。

sST2作为心衰标志物越来越受到基础及临床研究的关注，美国心脏病学院(ACC)和美国心脏协会(AHA)自2017年开始对sST2作为标志物在心衰中的临床应用进行了评价，并评估其在病例管理中的临床应用价值[2]。我国心脏疾病相关的诊疗指南中亦将该指标作为预测心衰预后的二级指标[3]。众多的临床研究亦表明，sST2、半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)等被认为具有预测心衰患者的病程和死亡预后价值[4-6]。因此，本研究对一种基于磁微粒化学发光法检测sST2的试剂盒进行性能评价，探讨其临床应用稳定性与可靠性。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2020年5至6月于南京市第一医院体检人群40例(男、女各20例，年龄：37.80±14.38岁)及60例临床病例(男vs女：43例vs 17例，年龄：67.32±13.86岁)，血清样本用于不同方法学试剂的平行对比试验。健康人群纳入标准：体检结果为正常；排除标准：(1)有免疫性疾病史；(2)近期有感冒及感染性疾病史；(3)有心血管及呼吸系统疾病史。临床病例样本为随机检测样本，依对比试剂检测结果，随机选择低、中、高值各20例。

1.2仪器与试剂 磁微粒化学发光法sST2测定试剂盒、CI2000S全自动化学发光免疫分析仪(北京利德曼生化公司), 胆红素及血红蛋白(上海信帆生物科技公司), 脂肪乳(西安立邦制药公司)，sST2蛋白检测试剂盒(ELISA法，天津康尔克生物科技公司)，ST-360酶联仪(上海科华生物工程公司)。

2 实验与结果

2.1精密度 按照CLSI-EP15-A2指南[7]要求，使用高、低2个水平的室内质控，质控品为厂家试剂盒提供的质控品及实验室自制的血清样本质控品，每个水平各分装5管(冷冻保存)，每天检测1次，共测5 d。计算批内和总变异系数(CV)。所选择的样本经过批内以及批间精密度检测结果显示，低水平及高水平血清样本的总CV值分别为2.2%和2.3%；低水平及高水平试剂盒质控品的总CV值分别为1.7%及1.5%；以上4组CV值均满足≤10%的要求。见表1。

表1 精密度检测结果

2.3线性范围 实验方法一：将接近线性范围上限的高值样本按比例稀释(1、1/2……1/512)，其中低值浓度的样本接近线性区间的下限。每个稀释浓度重复测试3次并求均值，计算线性相关系数r。认为合格标准的测量范围在1.00～300.00 ng/mL内，r应≥0.99。检测结果表明，在1.00～300.00 ng/mL范围内，血清样本r=0.999 9，试剂盒质控品线性范围为6.40～200.00 ng/mL，试剂盒质控品r=0.999 9，符合≥0.990 0。实验方法二：选择低浓度(L)和高浓度(H)患者标本各1份，H和L混合成6个样本，混合比例：L，4L+1H，3L+2H，2L+3H，1L+4H，H。每份混合样本测定2次，将实测值与预期值作回归分析。若r>0.95，a在0.97～1.03范围内，b与0没有显著差异，则可判断为线性，同时测定值与理论值偏差小于15%认为合格。检测结果表明，血清样本r=0.999 8,a=1.005 3;试剂盒质控品r=0.999 9,a=0.994 4。见图1。

注：A，血清样本方法学一线性范围检测结果；B，血清样本方法学二线性范围检测结果；C，试剂盒质控品方法学一线性范围检测结果；D，试剂盒质控品方法学二线性范围检测结果。

2.4最低检测限及灵敏度 最低检测限：取待检试剂盒中浓度为0的空白质控作为待测样本，对样本进行20次测定。同时取试剂盒中低浓度点标准品及血清进行2次测定。计算20次发光强度测量值的标准差(s)，通过内插法从标准曲线上读取sST2含量，即为空白检测限。若计算的灵敏度不能满足要求，需依据4倍均值法检查有无离群点，若有离群点，则允许删除1个点，并根据剩余19个数据计算最低检测限。结果表明，以待检试剂盒中0浓度点作为待测样本，20次重复测定的最低检测限为0.028 ng/mL，满足≤1 ng/mL的要求，对比试剂要求≤2 ng/mL。灵敏度检测：获得1份略低于厂商给定的定量限(limit of detection，LoQ)浓度的样本(用参考方法或已通过验证的方法确定该样本的靶值浓度A)，重复测定20次，计算CV值应<目标CV(通常是20%)。结果表明，低于试剂盒给定的LoQ浓度的样本经过20次重复测定，测定值<1 ng/mL，样本CV= 1.1%，最低检测限及灵敏度验证均符合要求。

2.5临床可报告范围 选取线性范围附近的高值样本，分别进行倍数稀释后，连同原浓度一起进行测试，重复检测2次取平均值。稀释后样本结果和原浓度样本结果进行比较，计算回收率。通过对高值样本血清以及试剂盒质控品进行稀释，计算回收率，结果表明，原倍、2倍(97.6%、98.9%)、5倍(101.2%、97.0%)、10倍(104.2%、98.2%)、20倍(100.3%、98.0%)、40倍(98.7%、103.4%)，证实血清样本及试剂盒质控品的40倍稀释结果可靠。

2.6参考区间验证 收集体检结果为正常的男、女各20份参考个体样本按要求各检测1次，如果40例参考个体中不超过4例的观测值在原始报告的参考区间之外则符合要求。使用磁微粒化学发光法试剂盒对收集的体检健康人群临床样本进行检测，结果表明，40例样本sST2检测最小值为0.45 ng/mL，最大值为29.43 ng/mL，平均值为8.26 ng/mL，所有样本检测值均在原始报告的参考区间之内，参考区间验证符合要求。

2.7临床样本测试 将磁微粒化学发光法sST2测定试剂盒与对照酶联免疫法试剂盒对同一临床样本进行平行测定，分别记录2种试剂盒的测定值,并使用配对t检验进行统计分析。使用2种不同方法学试剂盒对样本进行对比测试，2种方法阴、阳性不一致共3例，发生率为5%，阳性符合率为96.88%，阴性符合率96.55%，总符合率96.72%，配对t检验结果差异无统计学意义(t=0.582，P=0.563)，样本比对相关系数r为0.916 2。

2.8稳定性测试 设置3个条件分别对高低水平浓度的样本进行测试：(1)室温条件下：检测时间总长为72 h。间隔24 h测试1次，重复测试2次；(2)2～8 ℃条件下：将样本分装为7管，每天每浓度连续测试2次，连续测试7 d；(3)-20 ℃条件下：将样本分装为7管，每天每浓度连续测试2次，连续测试7 d。室温条件下样本在不同时间的检测结果表明，储存样本在室温间隔72 h后，测试高、低两水平样本与初始测试结果的相对偏差分别为-15.3%及-14.6%。2～8 ℃冰箱内储存样本在7 d后，测试高、低水平样本与初始测试结果的相对偏差分别为-0.44%及0.39%。-20 ℃冰箱内储存样本在7 d后，测试高、低水平样本与初始测试结果的相对偏差分别为-2.08%及-0.72%。见图2。

注：A,血清-20 ℃储存时不同静置天数下sST2检测结果；B，血清2～8 ℃储存时不同天数下sST2检测结果；C，血清室温储存时不同天数下sST2检测结果。

2.9干扰实验 分别取高、低浓度血清样本，分别加入胆红素(0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L)、血红蛋白(2.5 g/L、5 g/L、10 g/L)、脂肪乳(5 g/L、10 g/L、20 g/L)等3个梯度的干扰物质，以加入基质的样本作为对照，按照常规检验程序进行平行测定，计算加之前与加之后的相对偏差，以偏差不超过15%认为合格。结果表明加入不同浓度的胆红素、血红蛋白、脂肪乳后的标本相对偏差均不超过15%。见图3。

注：A，血清样本中不同浓度胆红素干扰实验结果；B，血清样本中不同浓度血红蛋白干扰实验结果；C，血清样本中不同浓度脂肪乳干扰实验结果。

3 讨论

sST2临床应用的优势在于其变异度受到心衰人群中普遍合并症的影响较小，与炎症状态和合并症高度相关的sST2在射血分数保留的心力衰竭病程监测中具有独特的应用优势。研究表明，sST2连续监测可以作为疗效监测及预后判断的指标，对于制定治疗方案及心衰精细化的管理显示出良好的应用前景[8]。故本研究对基于磁微粒化学发光法的试剂盒从精密度、重复性、线性范围、最低检测限、临床可报告范围、参考区间验证、临床样本对比测试、样本稳定性测试、干扰实验等9个方面对sST2检验试剂盒进行了验证，结果显示，该试剂盒检测效能均符合临床需求。

磁微粒化学发光法是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种新型分析方法[9]，利用磁微粒包被相应的抗原抗体，结合酶标抗体以检测目的抗原或抗体。该法具有高灵敏度，高准确性及稳定性好等特点，已经在临床广泛应用，如：乙肝表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体(TP)抗体、人类免疫缺陷病毒抗体定量检测等方面[10]。此外，该法还可用于25-羟基维生素D的检测且被证实具有较高的准确性及灵敏度[11]。ELISA法在临床试验中广泛使用，因此，笔者将本研究建立的方法与ELISA法试剂盒同时测定40例临床样本，比对结果表明，2种方法结果差异不具有统计学意义，2种方法相比较而言，磁微粒化学发光法克服了ELISA法受反应温度、反应时间及加样等因素的影响。本实验中发现有3例样本存在两试剂盒检验阴阳性不一致的结果，其中1例患者为左心耳介入封堵术后，ELISA法测值高于参考值1 ng/mL，位于临界值附近，磁微粒化学发光法检测的ST2水平较参考值低5 ng/mL，这可能与两方法所设定的cut-off值不同有关。2例患者采用两方法检测结果相差较大，可能由两试剂盒选定的抗体不同或2种试剂盒抗体的标记方法不同从而导致敏感性不同；此外，磁微粒化学发光主要是用磁珠做载体，ELISA是固相载体，这也可能导致ST2检测结果有差异。因此，建议患者临床检测结果出现可疑值时需结合病史，必要时进行多次检测，为临床治疗提供可靠依据。

sST2目前临床开展应用较少，鲜有研究从方法学角度对该指标进行评价，本研究虽从多个角度阐述基于磁微粒化学发光法检测sST2的可靠性，但本研究检测的样本还相对较少，还未完全评价涉及的影响临床样本结果的因素，因此，本研究结果还有待于更多的临床试验结果的验证。

综上，本研究对基于磁微粒化学发光法的sST2检测试剂盒进行性能验证，结果显示精密度、重复性、线性范围、最低检测限、临床可报告范围、参考区间验证、临床样本测试、样本稳定性测试、干扰实验验证均符合的要求。本研究可供其他sST2检测性能验证的设计作为参考。