蒋萍萍，叶宁，徐宝灵(.桂林医学院第二附属医院急诊科，广西桂林5400；.桂林医学院附属医院急诊科，广西桂林 54000)

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是急性肺损伤(ALI)的最终严重阶段，病死率高达40%以上。因此，筛选出ARDS发病和预后的生物学标志物至关重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是小的非编码RNA，其表达失调可能参与许多疾病的发病机制。有学者证实，miRNAs在ARDS发病机制和进展过程中具有潜在的临床应用价值[1]。另有研究表明，miRNA在ARDS炎症反应中发挥着不可忽视的作用[2-3]。miR-150是定位于19q13.33，长度为2 nt的单链miRNA，miR-150通过直接靶向丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(AKT3)表达，减轻脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤[4]。然而，miR-150在ARDS中发病机制中作用的文献报道少见。本研究通过检测ARDS患者血清中miR-150的表达水平，分析其表达的临床意义，评估其筛查或预后预测价值。

1 资料与方法

1.1临床资料 收集2018年1月至2019年11月于桂林医学院第二附属医院急诊科就诊的ARDS患者50例，男31例，女19例；年龄(55.08±11.52)岁；BMI(23.25±2.27)kg/m2；APACHE Ⅱ评分(24.18±8.46)分。纳入标准[5]：(1)符合ARDS诊断标准；(2)入住ICU时间>72 h。排除标准：(1)年龄<18岁；(2)自身免疫病患者；(3)急性肺疾病或者慢性阻塞性肺疾病患者；(4)肿瘤或伴有肝、肾等其他脏器功能障碍患者。选取同期体检的50例体检健康者作为健康人对照组，男32例，女18例；年龄(55.14±12.14)岁；BMI(23.42±2.12)kg/m2。两组研究对象年龄、性别和BMI间差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经桂林医学院第二附属医院医学伦理委员会批准(批准文号：2017GLMU1AYJS083)，患者及家属均知情同意。

1.2标本采集 采集ARDS患者入院第1天(体检健康者于体检当日)的空腹静脉血10 mL，置于生化采血管中，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，分离并收集血清，置于-80 ℃保存。

1.3主要仪器及试剂 MR-96A酶联免疫检测仪(武汉科尔达医疗科技公司)，CFX96实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，Microfuge 20R高速冷冻离心机(美国贝克曼公司)。miRNeasy Serum/Plasma Kit(德国Qiagen公司)，Prime Script RT试剂盒、Perfect Real time染料法实时荧光定量试剂盒(日本TaKaRa公司)，miR-150和U6扩增引物(上海生工公司)。

1.4RNA提取、逆转录反应 按照miRNeasy Serum/Plasma Kit说明书提取总RNA，采用紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，取吸光度(A260/280 nm)值为1.8～2.0的样本。按Prime Script RT试剂盒说明书将miRNA逆转录为cDNA，样本置于-20 ℃保存。

1.5RT-qPCR检测 根据NCBI中GenBank提供的miR-150(序列号：NC_000019.10)，U6(序列号：NC_000898.1)的基因序列，由上海生工公司设计并合成引物，引物信息见表1。将获得的cDNA采用Perfect Real time染料法，按照实时荧光定量试剂盒说明书进行扩增，反应体系为20 μL，包括：2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 12 μL。循环参数：95 ℃变性30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40个循环，在60 ℃时采集荧光信号，并用实时荧光定量PCR仪自带的CFX96 Real-Time PCR Detection System软件进行熔解曲线分析。以U6为内参照，并采用2-△△Ct法进行相对定量分析。

表1 引物序列信息

1.6统计学分析 数据均使用SPSS 24.0软件包进行统计学分析。采用卡方检验分析血清中miR-150的表达水平与ARDS患者临床病理参数的关联。采用Pearson分析miR-150的表达与APACHE Ⅱ评分的相关性。Kaplan-Meier生存曲线进行生存分析。生存资料的多因素分析应用Cox回归模型。根据ARDS组与健康人对照组血清miR-150的表达水平绘制ROC曲线，以评价血清miR-150用于评估ARDS的筛查价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1ARDS患者血清中miR-150的表达水平比较 与健康人对照组(5.44±1.27)相比，ARDS患者血清中miR-150的表达水平(2.18±0.87)显著降低(t=14.972，P<0.05)。

2.2ARDS患者临床病理资料分析 以miR-150表达水平的平均数(2.18)为界值，将ARDS患者分为低表达组(n=27)和高表达组(n=23)，结果发现，miR-150低表达和APACHE Ⅱ评分有关(χ2=4.154，P=0.042)，而与患者年龄、性别、BMI以及吸烟史均无关(P>0.05)。见表2。

表2 ARDS患者临床病理参数的比较

2.3ARDS患者血清miR-150表达水平与APACHE Ⅱ评分的相关性 Pearson分析结果显示，ARDS患者血清miR-150的表达水平与APACHE Ⅱ评分呈负相关(r=-0.826，P<0.05)。进一步分析miR-150低表达组和高表达组与APACHE Ⅱ评分相关性，结果显示，血清miR-150低表达组与APACHE Ⅱ评分呈负相关(r=-0.436，P<0.05)，而血清miR-150高表达组与APACHE Ⅱ评分无相关性(r=-0.299，P>0.05)。

2.4血清miR-150水平与ARDS患者生存期的关系 Kaplan-Meier生存曲线显示，血清miR-150低表达ARDS患者的28 d生存率显著低于高表达者(33.33% vs 82.61%，χ2=12.320，P<0.001)。见图1。Cox回归分析显示，ARDS患者生存期与血清miR-150表达水平和APACHE Ⅱ评分均有关。见表3。

图1 miR-150表达水平与ARDS患者生存期的关系

表3 多因素Cox回归分析患者生存期的影响因素

2.5血清miR-150用于筛查ARDS的价值 根据ARDS组与健康人对照组血清miR-150的表达水平绘制ROC曲线。miR-150筛查ARDS的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.988(95%CI：0.975～1.000)，当cut-off值为3.36时，其敏感性和特异性分别为96%和88%。见图2。

图2 miR-150筛查ARDS的ROC曲线

3 讨论

ARDS病因复杂，发病机制尚不明确，miRNA作为调控因子在ARDS的发病和预后中发挥重要作用[6]。近年来研究发现，miR-150在恶性肿瘤、系统性硬化病、肺动脉高血以及组织纤维化等多种疾病中呈异常表达[7]。本研究检测ARDS患者血清中miR-150的表达，结果发现miR-150在ARDS患者血清中低表达，且与APACHE Ⅱ评分相关呈负相关。本研究与Wei等[8]研究结果相似，其结果亦证实，血液循环中的miR-150呈异常表达。APACHE Ⅱ评分系统由急性生理学评分(APS)、年龄评分、慢性健康状况评分3个部分组成，可作为评估ICU患者病情和预后的指标[9]。笔者进一步采用Kaplan-Meier生存曲线分析，结果显示，血清miR-150低表达的ARDS患者28 d生存率显著低于血清miR-150高表达者。Cox回归模型结果表明，ARDS患者生存期与血清miR-150表达水平以及APACHE Ⅱ评分相关，这与Li等[4]研究相一致，其结果表明，miR-150表达水平在ARDS患者的血清中显著降低，并且与疾病严重程度和ARDS 28 d生存率呈负相关。提示miR-150水平与ARDS患者病情严重程度和预后具有一定的相关性，可作为患者预后的重要生物学标志物。

miRNA有望成为ARDS潜在的诊断指标和治疗靶点。研究表明，miR-122高表达与ARDS患者病情严重程度及预后相关，且miR-122联合APACHE Ⅱ评分对ARDS患者预后具有较高的评估价值[10]。本研究采用ROC曲线对血清miR-150筛查ARDS的价值进行分析，结果表明，miR-150筛查ARDS的AUCROC为0.988(95%CI：0.975～1.000)，敏感性和特异性分别为96%和88%。这与Gan等[11]研究结果一致，其研究表明髋部骨折后急性肺损伤(ALI)患者血清miR-150的表达明显降低，进一步进行线性回归分析结果显示，血清miR-150与肺组织学得分显著相关，且在髋部骨折后ALI患者的辅助诊断具有一定的价值。以上研究提示血液循环中的miR-150可能成为ARDS早期筛查及预后的生物学标志物。

综上所述，miR-150在ARDS患者血清中低表达，并与APACHE Ⅱ评分以及预后相关，有望成为ARDS发病和预后预测的生物学标志物。但是本研究尚存一些不足：(1)样本量较少，预后及筛查相关结果需通过扩大样本量进行验证并补充；(2)未进行连续动态监测miR-150的变化水平及疗效评价；(3)本文缺乏相关作用机制研究，后期需通过体内动物实验进行完善与补充。