虞凤慧，成道泉，王祥传，周 倩，吴文雷，张 骞，杨传伦，韩立霞，吴 磊，刘海玉，徐泽平,4

（1黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东滨州256500；2京博农化科技有限公司，山东滨州256500；3山东京博控股集团有限公司，山东滨州256500；4滨州市环境微生物技术工程研究中心，山东滨州256500）

0 引言

番茄是中国设施（温室）栽培面积最大的蔬菜，温室番茄种植过程中常见的病害包括病毒病[1-2]以及灰叶斑病、叶霉病[3]、早疫病[4-6]、晚疫病[7-8]等真菌性病害。由于温室小气候具有高湿、低通风、温度高等特性，适合病原微生物生长、繁殖和扩散，使得病害易发、叠发、病情严重。高频次、高剂量施药是生产实践中通常采用的病害防治方法，但也带来农药抗性增强、农药残留、劳动量大等问题，同时对番茄品质和产量造成很大影响。壳寡糖锌是壳寡糖（又名氨基寡糖素[9]）与无机锌经过特定反应形成的螯合物或配合物，是一种新型功能性肥料。壳寡糖锌既保留了壳寡糖的原有活性，又为作物提供了生长必需的锌元素，并呈现出协同增效作用。因此，施用壳寡糖锌可显著增强作物抗病能力，促进作物生长，提高农产品品质和产量，且有助于化肥、农药减量增效，提高农产品安全性和农户经济效益，对绿色农业发展具有重要意义。近年来，已有一些关于壳寡糖锌及其相关产品在抑菌、农业生产等方面的应用报道[10-14]，如侯华民[15]等研究发现，壳寡糖锌可使油菜产量提高16.5%。Higazy等[16]以壳聚糖(160000 Da)为原料，制备了壳聚糖锌配合物，发现其对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌具有显著抑制活性[17]。卢琪洁等[17]以壳寡糖(500～1000 Da)为原料，制备了壳寡糖锌配合物，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌效果较好。刘文欢等[18]将壳寡糖与硫酸锌等营养成分复配，于小麦上喷施，可分别提高小麦产量和千粒重15.05%和12.39%以上。但总体来看，尚未有人对壳寡糖锌防治作物病原菌的效果进行系统评价，也缺乏壳寡糖锌在经济作物上的应用表现数据，在一定程度上限制了该类产品的开发和推广。而且，从已上市的产品来看，国内外生产壳寡糖锌的厂家较少，国内主要有北京标驰农业科技开发中心（产品为寡糖锌）和海南正业中农高科股份有限公司（产品为海洋寡糖锌），国外主要为以色列海法农业化学集团。其他相关产品多为含锌的壳寡糖复配产品。本研究产品为壳寡糖锌螯合物，锌与壳寡糖糖链中的-NH2结合，形成结构稳定的螯合物，有别于壳寡糖与锌盐复配产品，螯合态的锌更容易被作物吸收利用[19-22]。壳寡糖锌属于安全、绿色、环保型农用产品，目前，关于壳寡糖锌在作物抗病、促生、增产方面的报道较少。本研究以温室番茄为供试作物，自番茄幼苗期开始施用壳寡糖锌，研究其对番茄的防病效果及果实品质和产量的影响。期望为绿色农产品的生产提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试番茄：‘粉德利618’，购于寿光市金农种业。

供试药剂：壳寡糖锌（有效物质含量3.45%），本实验室自制；氢氧化铜制剂、苦参总碱、稻瘟酰胺（有效物质含量20%），市售产品。

供试病原菌：黄瓜角斑病原菌(Pseudomonas syringaepv.lachrymans)、姜瘟病原菌(Ralstonia solanacearum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、辣椒疫霉病原菌(Phytophthora capsiciLeonian)、苹果腐烂病原菌(Valsa mali Miyabeet Yamada)、小麦赤霉病原菌(FusaHum graminearumSehw)、水稻纹枯病原菌(Rhizoctonia solaniKühn)和棉花枯萎病原菌(Fusarium oxysporumf.sp.Vesinfectum)，本实验室保存。

LB培养基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂20 g，pH 7.0，121℃灭菌20 min。

PDA培养基：土豆200 g，煮沸30 min，纱布过滤，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，121℃灭菌20 min。

1.2 主要仪器

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-ID型单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；HZQ-Q全温振荡培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 壳寡糖锌对细菌的抑制作用 选取黄瓜角斑病原菌、姜瘟病原菌、大肠杆菌3种细菌为抑菌对象，活化菌种，确定最适菌液浓度。配制LB固体培养基、灭菌，培养基冷却至40～50℃时，加入不同浓度的药剂，制成含药平板。以不加任何药剂的LB培养基作为空白对照。取1×106CFU/mL的菌液100 μL均匀涂布于平板上，每个处理3个重复，37℃培养24 h后计数，根据菌落个数确定最低抑菌浓度(MIC)。

1.3.2 壳寡糖锌对真菌的抑制作用 选取辣椒疫霉病原菌、苹果腐烂病原菌、小麦赤霉病原菌、水稻纹枯病原菌和棉花枯萎病原菌为抑菌对象，活化菌种。配制PDA固体培养基，灭菌，培养基冷却至40～50℃时，加入不同浓度的药剂，制成含药平板。以不加任何药剂的PDA培养基作为空白对照。用直径6 mm的打孔器取已活化的病原菌菌块，菌丝面朝下，接种于含药平板中央，每个处理3个重复，28℃培养5天。用十字交叉法量取菌落直径并计算抑制率，确定最低抑菌浓度(MIC)。

1.3.3 壳寡糖锌对番茄病害的防治效果 试验在山东博华高效生态农业科技有限公司蔬菜基地的番茄温室中进行。供试土壤肥力中等，长期以种植蔬菜为主。试验组喷施壳寡糖锌，对照组未喷施壳寡糖锌（温室正常管理），面积各0.067 hm2。采用茎叶喷雾法，分别在番茄幼苗期（定植1周后）、开花尾期、结果期施药，每个时期各施药2次，每次间隔7～10天，壳寡糖锌用量为2.25 L/(hm2·次)。每次施药前后，观察番茄植株发病情况。

1.3.4 壳寡糖锌对番茄植株生长、果实品质及产量的影响 在温室番茄生长的整个时期，观察番茄的生长情况，测量番茄株高和茎粗，确定相对增长量。同时，随机取样，测定成熟番茄中可溶性固形物、总酸、还原糖、维生素C、锌的含量，计算固酸比，评价番茄品质，测定产量。

2 结果与分析

2.1 壳寡糖锌对细菌的抑制作用

由表1可知，在对细菌性病原菌的抑菌实验中，壳寡糖锌与对照药剂—壳寡糖、氢氧化铜制剂和苦参总碱对黄瓜角斑病原菌、姜瘟病原菌和大肠杆菌均有不同程度的抑制作用，且随着药剂浓度的增加，抑菌效果增强。根据平板上菌落数量确定各药剂的最低抑菌浓度(MIC)，如表2所示。

表1 不同药剂对细菌的抑制效果 菌落数/个

由表2可知，与作物细菌性病害常用的防治农药—氢氧化铜制剂和植物性杀菌剂—苦参总碱相比，壳寡糖锌对黄瓜角斑病原菌、姜瘟病原菌和大肠杆菌的抑制效果最好，MIC值均为0.05%，较对照药剂降低50%～75%。同时，壳寡糖锌对3种病原菌的MIC值仅为壳寡糖的1/2～1/4，这可能与两者不同的抑菌机制有关。壳寡糖在中性环境中带正电荷，正电荷与微生物细胞膜表面的负电荷之间的相互作用，改变了微生物细胞膜的通透性，引起微生物细胞死亡[23]，这种作用具有高度的剂量依赖性。壳寡糖锌呈电中性，容易穿过细胞膜进入胞内，并在胞内转变为壳寡糖和锌，壳寡糖能够与胞内核酸、蛋白等大分子结合，干扰细胞正常代谢，引起细胞死亡。

表2 不同药剂对细菌的最低抑菌浓度(MIC)

2.2 壳寡糖锌对真菌的抑制作用

由表3可知，在对真菌性病原菌的抑菌实验中，壳寡糖锌对辣椒疫霉病原菌、苹果腐烂病原菌、小麦赤霉病原菌、水稻纹枯病原菌和棉花枯萎病原菌均有一定抑制作用，且随着药剂浓度的增加，抑菌效果增强。而稻瘟酰胺的抑菌效果次之，随着药剂浓度的增加，稻瘟酰胺对小麦赤霉病原菌、水稻纹枯病原菌和棉花枯萎病原菌的抑菌效果无明显增强，且药剂效果不稳定。根据菌丝抑制率确定各药剂的MIC，如表4所示。

表3 不同药剂对真菌的抑制效果

表4 不同药剂对真菌的最低抑菌浓度(MIC)

由表4可知，与作物真菌性病害常用的防治农药—稻瘟酰胺相比，虽然壳寡糖锌对真菌性病原菌的MIC无明显降低，但其抑菌谱相对较广，对5种病原菌均有抑制作用。而稻瘟酰胺仅对辣椒疫霉病原菌和苹果腐烂病原菌有较好抑制作用。由此可见，壳寡糖锌综合抑菌效果优于对照药剂—稻瘟酰胺。

鉴于壳寡糖锌对细菌性和真菌性病原菌均有较好的抑制作用，因此，通过田间试验验证壳寡糖锌对温室番茄病害的防治效果，以及对番茄植株生长、果实品质及产量的影响。

2.3 壳寡糖锌对番茄病害的防治效果

在番茄生长的各个时期施药前后，观察植株发生病害情况。如图1所示，番茄成熟期，试验温室的番茄植株发生了较为严重的病害，相比于对照组，喷施壳寡糖锌的番茄植株发病数量明显减少，且病情较轻，整片叶子几乎无明显的斑点。比较而言，壳寡糖锌对温室番茄病害呈现出明显的防治效果。

图1 壳寡糖锌对番茄病害的防治效果

2.4 壳寡糖锌对番茄植株生长、果实品质及产量的影响

2.4.1 壳寡糖锌对番茄植株生长的影响 在番茄幼苗期，于喷施药剂前后（施药2次），分别随机选取20株番茄植株，利用卷尺和游标卡尺分别测量株高和茎粗，并计算平均相对增量，结果见表5。后期番茄植株太高，测量误差较大，不再统计生长量。

由表5可知，与对照组相比，喷施壳寡糖锌的实验组番茄株高增长17.11%，茎粗增长53.89%。

表5 壳寡糖锌对番茄植株生长的影响

2.4.2 壳寡糖锌对番茄品质的影响 在番茄成熟期，随机选取成熟度一致的番茄，测定可溶性固形物、总酸、还原糖、维生素C、锌的含量，方法分别为NY/T 2637-2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的测定折射仪法》、GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定酸碱滴定法》、DNS法、GB 6195-86《水果、蔬菜维生素C含量测定（2,6-二氯靛酚滴定法）》、ICP-MS，并计算固酸比。

与对照组相比（见表6），在番茄生长整期，喷施壳寡糖锌使番茄酸度降低了5.38%，同时，显著提高了番茄的可溶性固形物、还原糖、维生素C、锌含量及固酸比，相对增量依次为5.88%、27.88%、51.60%、87.91%、11.90%。其中，锌含量大幅增加。

表6 壳寡糖锌对番茄品质的影响

2.4.3 壳寡糖锌对番茄产量的影响 在番茄收获阶段，分别统计试验组和对照组番茄总产量以及一级果、二级果、次果的总量，见图2。

如图2所示，喷施壳寡糖锌后，番茄总产量和一级果产量显著高于对照组，分别增产23.35%和30.73%，且未见二级果和次果。由此可见，自番茄幼苗期至结果期喷施壳寡糖锌，可明显提高番茄果实品质及产量。

图2 壳寡糖锌对番茄产量的影响

3 讨论

本实验室将壳寡糖与锌有机结合，开发出壳寡糖锌螯合产品。本文研究了壳寡糖锌对多种植物病原菌的抑制效果及其在温室番茄上的应用效果。从室内抑菌实验来看，壳寡糖锌对多种植物细菌性和真菌性病原菌均具有较好的抑制效果，其MIC值与常用化学杀菌剂相比明显降低。从对温室番茄病害的防治效果来看，自番茄幼苗期开始，多次喷施壳寡糖锌可明显减少和减轻番茄植株病害的发生，与对照组差异显著。从对番茄植株生长的影响来看，壳寡糖锌可同时促进番茄株高和茎粗增长，增量明显高于对照组。从对番茄果实品质及产量的影响来看，壳寡糖锌可提高番茄果实中可溶性固形物、还原糖、维生素C、锌含量及固酸比。其中，锌含量增加幅度最大，说明锌元素被番茄植株有效吸收、利用，并在番茄果实中富集。同时，总酸含量降低，使番茄品质和口感更佳。而且，施用壳寡糖锌能够明显提高番茄总产量和一级果产量，降低二级果和次果产量。这与侯华民等[15]公开的含有机锌的组合物（壳聚糖锌或壳寡糖锌等）对多种作物具有增产、改善品质等作用相一致，且部分效果更优。

综上可知，壳寡糖锌对抑制植物病原菌及对作物防病、增产等多方面具有明显作用。本研究仅初步探索了单独、多次喷施壳寡糖锌在温室番茄上的良好应用效果，但具体的作用机理仍有待进一步研究。同时，后续仍需在其他作物上推广应用，并根据作物不同生长阶段的营养需求及病害防治情况，考察壳寡糖锌单独冲施及其与叶面肥、腐植酸水溶肥、氨基酸水溶肥、化药等复配应用的效果，明确壳寡糖锌的施用方式和应用范围。

4 结论

壳寡糖和锌在农业生产上有良好的应用效果[24-30]，其中，壳寡糖作为一种植物免疫诱抗剂，对人、畜安全，长期或多次使用不会使植物产生特异性抗药性[31]。但二者分别存在速效性差、不易被吸收利用等弊端，降低了其本身所具有的良好功效。本实验室开发的壳寡糖锌为真正的螯合产品，非壳寡糖与锌元素的简单混配。产品中未引入氯离子、硫酸根离子、硝酸根离子，因此，作为壳寡糖的衍生物，壳寡糖锌不仅施用更安全，对作物和土壤均无不良影响，而且功能更全面、功效更好，又高效地为作物提供了生长必需的锌元素。施用壳寡糖锌可显著提高作物体内相关酶的活性，促进作物光合作用和植株生长，增强作物的抗病能力[32]，提高农产品品质和产量[33-34]。与已有报道相似，如周林媛等[27]将壳寡糖与镁锌混配，可较好抑制烟草花叶病毒(TMV)侵染和提高烟株抗性。王士奎等[13]研究的寡聚酸合锌(Ⅱ)对烟草病毒病具有较强的防治作用。

为探讨壳寡糖锌在田间的抗病、促生、增产等应用可行性，本研究中，首先针对性地选择了几种常见的植物细菌性和真菌性病原菌，明确壳寡糖锌的抑菌效果。研究证明，壳寡糖锌对所选病原菌的抑菌效果均优于市售对照药剂，其中，对细菌性病原菌的抑菌优势明显，MIC值较对照药剂降低50%～75%。同时，MIC值仅为壳寡糖的1/2～1/4。其次，以温室番茄为供试作物，跟踪了壳寡糖锌的田间应用效果。结果表明，喷施壳寡糖锌的番茄植株发病数量较对照组明显减少，且病情较轻，即壳寡糖锌对温室番茄病害防效明显。同时，壳寡糖锌促使番茄株高和茎粗增长17.11%和53.89%，番茄果实的可溶性固形物、还原糖、维生素C、锌含量及固酸比分别增加5.88%、27.88%、51.60%、87.91%、11.90%。其中，锌含量大幅增加，而番茄酸度降低了5.38%，使番茄品质显著提高，口感明显提升。除此之外，番茄总产量和一级果产量分别增加23.35%和30.73%，显著高于对照组，且无二级果和次果。

综上所述，壳寡糖锌抗菌谱广，可有效防治番茄病害，促进番茄植株生长，提高番茄果实品质和口感，增加产量。壳寡糖锌兼具药肥两用的功效，且用量少、应用成本低、安全环保、减药（肥）增效，不易产生抗药性，具有巨大的开发价值和市场前景。但仍需在作用机理及应用的广泛性方面做进一步研究。