张双奇，刘 琳，何念武，赵 颖

（1商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛726000；2丹凤县农业技术推广中心，陕西商洛726000)

0 引言

天麻(Gastrodia elata Bl.)为兰科天麻属多年生草本植物，生长于海拔400～3200 m潮湿冷凉的沙质土壤林地，其块茎可入药且是中国的名贵中药材[1-3]。天麻中的化学成分主要有酚类及其苷类、多糖类、有机酸类、甾醇类以及多种氨基酸和人体所需的微量元素等[4-5]。例如天麻素（对羟甲基苯甲醇-β-D-吡喃葡萄糖苷）、天麻多糖(GBP-Ⅰ、GBP-Ⅱ)[6]、天麻苷元（对羟基苯甲醇）、对羟基苯甲醛、巴利森苷C、巴利森苷A、腺苷、胡萝卜苷、对羟苄基乙基醚、对羟苄基甲醚、β-谷甾醇、棕榈酸、邻苯二甲酸二甲酯等[7-8]。

目前的研究结果表明，天麻素和天麻多糖是天麻主要的有效成分，天麻素具有镇静催眠、保护脑部神经和减轻由兴奋性氨基酸对神经系统引起的兴奋性毒性作用[9-11]；天麻多糖具有抗氧化性，且可有效延缓骨骼肌衰老[12-13]。目前常用的天麻多糖提取方法主要有热水浸提法、酶解法及回流醇沉法等，多糖的得率总体为9%～23%[14-15]，而当在提取过程中加入超声波辅助后，天麻多糖得率可提高到30%[16-17]。

另外有研究结果表明，由于海拔、温湿度、光照、土壤等自然条件的限制，不同产地天麻的有效活性成分、水分、粗脂肪、粗纤维等含量存在显著差异[18-19]。陕西商洛地处中国中纬度偏南地带，位于秦岭南麓，分布在北亚热带和暖温带交界区域，平均海拔800～1200 m，土壤有效磷含量为中磷水平且富含有机质[20-21]，因此商洛也属于高品质天麻的主产地之一。商洛天麻的水分、总灰分含量均低于《中国药典》（2015年版）标准，天麻素和对羟基苯甲醇的含量则达到了标准的2.5倍以上[22]，但针对商洛天麻的理化特性而进行的研究非常少，故本文以商洛春麻为原材料，以超声波辅助热水浸提法对天麻多糖的提取工艺进行了优化，再进行天麻多糖的体外抗氧化活性的研究，以期为商洛当地天麻的深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

天麻，购于陕西商洛（经鉴定为兰科天麻属腐生草本植物）。DPPH（上海源叶生物科技有限公司）；抗坏血酸（北京索莱宝科技有限公司）；苯酚、乙醇、浓硫酸、三氯甲烷、葡萄糖、水杨酸钠、亚硫酸亚铁等均为分析纯试剂。该试验于2019年11月—2020年4月，在商洛学院生物医药与食品工程学院生物学实验中心进行。

1.2 仪器与设备

超声波清洗机（KH-300DE，北京中西远大科技有限公司），紫外可见分光光度计（T2600，上海佑科仪器仪表有限公司），高速离心机（HC-3018，安徽中科中佳科学仪器有限公司），多功能粉碎机（ME204E，济南安环医疗器械有限公司），旋转蒸发仪（RE-301，上海况胜科技有限公司），电子分析天平（GL1004C，上海佑科仪器仪表有限公司）。

1.3 提取工艺优化方法

1.3.1 提取方法 本试验在借鉴已有提取方法的基础上，提出了超声波辅助热水浸提法，具体流程见图1。

图1 超声波辅助热水浸提流程

1.3.2 标准曲线的绘制 采用苯酚-硫酸法。分别吸取1 mg/mL的葡萄糖标准溶液1、2、3、4、5、6、7 mL定容至50 mL备用，分别量取1 mL上述容液于不同锥形瓶中，各加入1 mL浓度为5%的苯酚溶液和5 mL浓硫酸，40℃水浴20 min，在490 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.3 天麻多糖含量的测定 量取1.3.1节方法中制得的天麻粗多糖样品，配制质量浓度为1 mg/mL的天麻粗多糖溶液，按照1.3.2节方法测定吸光度，按照公式(1)计算天麻多糖含量[23]。

其中P为天麻多糖含量(mg/g)，C为样品溶液中天麻多糖质量浓度(μg/mL)，V为样品定容体积(mL)，M为原料质量(g)。

1.3.4 单因素试验 本试验以料液比(1:25、1:30、1:35、1:40、1:45)、水提温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)、水提时间(25 min、30 min、35 min、40 min、45 min)作为主要影响因子，并在每个因素中筛选效果显著的3个水平量，设计L9(34)正交试验，分析得出超声波辅助热水浸提法提取天麻多糖的最优参数。

1.4 体外抗氧化活性测定方法

1.4.1 DPPH自由基清除能力的测定 取1 mL不同质量溶度的样品(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)分别放于试管1、2、3、4、5、6、7中，然后依次加入3 mL 0.004% DPPH-乙醇溶液，充分混匀，避光静置20 min后，517 nm波长处测吸光度A，以乙醇代替样品为空白对照测得吸光度A0，以无水乙醇代替DPPH-乙醇溶液测得吸光度A1，Vc作阳性对照，再按照公式(2)计算DPPH自由基清除率[24]。

其中D为DPPH自由基清除率，A为3 mL 0.004% DPPH-乙醇溶液+1 mL样品溶液的OD值；A1为3 mL无水乙醇+1 mL样品溶液的OD值；A0为3 mL无水乙醇+1 mL无水乙醇的OD值。

1.4.2 羟基自由基清除能力测定 利用Feton体系法测定，取1 mL不同质量溶度的样品(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)分别放于试管1、2、3、4、5、6、7中，依次加入10 mmol/L水杨酸钠-乙醇溶液、10 mmol/L亚硫酸亚铁溶液、8.8 mmol/L过氧化氢溶液各1 mL，充分混匀，于37℃下恒温水浴30 min。反应结束后于510 nm处测定样品吸光值A。以蒸馏水代替样品溶液测得A0，以蒸馏水代替过氧化氢溶液测得A1，按照公式(3)计算羟基自由基清除率[25]。

其中E为羟基自由基清除率，A为1 mL样品溶液+1 mL水杨酸钠-乙醇溶液+1 mL亚硫酸亚铁溶液+1 mL过氧化氢溶液；A1为1 mL样品溶液+1 mL水杨酸钠-乙醇溶液+1 mL亚硫酸亚铁溶液+1 mL蒸馏水；A0为1 mL蒸馏水+1 mL水杨酸钠-乙醇溶液+1 mL亚硫酸亚铁溶液+1 mL过氧化氢溶液。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

按照1.3.2标准曲线的绘制方法，绘制葡萄糖标准曲线，标准曲线的线性回归方程为：y=0.0094x-0.0232，R2=0.9973，结果见图2。

图2 葡萄糖标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对天麻多糖提取率的影响 料液比对天麻多糖提取率的影响结果见图3。在提取温度为60℃，提取时间为40 min时，提取率随液料比的增大呈现出先增后减的趋势，在料液比为1:40 g/mL多糖提取率达到峰值。可能是因为随着溶剂的增大，天麻粉末与溶剂的接触面积变大，导致可溶性多糖溶出比率升高，但当料液比超过1:40 g/mL后，溶液已达饱和，故溶出比率提升不明显[26]，故初步确定料液比为1:40 g/mL。

图3 料液比对多糖提取率的影响

2.2.2 水提温度对天麻多糖提取率的影响 水提温度对天麻多糖提取率的影响结果见图4。在提取时间为35 min，料液比为1:40 g/mL的条件下，提取率随温度的增加而增加，但在温度高于60℃后，提取率增加趋于平缓。随着水提温度的升高，多糖的溶解度逐步增大，但温度过高可能会导致多糖的糖链断裂，致使多糖难于回收[27]，故初步确定水提温度为60℃。

图4 提取温度对多糖提取率的影响

2.2.3 水提时间对天麻多糖提取率的影响 水提时间对天麻多糖提取率的影响结果见图5。在提取温度为60℃，料液比为1:40 g/mL的条件下，提取率随时间的增加而增加，但在提取时间大于40 min后，提取率增加效果不显著。多糖长时间处于高温提取环境下，可能会发生多糖的降解，造成多糖杂质较多[28]，故初步确定水提时间为40 min。

图5 提取时间对多糖提取率的影响

2.3 正交试验结果

2.3.1 因素与水平的确定 根据上述单因素试验结果，筛选出料液比、提取温度、提取时间3个影响超声波辅助热水浸提法提取天麻多糖工艺的最优参数，并以其作研究对象，以提取率作研究指标，设计L9(34)正交试验，因素水平见表1。

表1 因素水平表

2.3.2 正交试验分析 以通过公式(1)得到的天麻多糖含量为研究指标，按表1进行正交试验分析，结果见表2。由表2可知，对于超声波辅助法提取天麻多糖的影响最大的因素依次为料液比(B)、提取时间(C)和提取温度(A)。

表2 超声波辅助提取正交实验结果

2.3.3 方差分析 超声波辅助法提取天麻多糖正交试验方差分析结果见表3。从表3可知，A因素(F0.05＜F＜F0.01)为有显著意义，B和C因素(F0.1＜F＜F0.05)为较显著意义。故根据k的变化率可得到各因素的优先顺序为A＞C＞B，即最优工艺组合为提取温度取65℃，料液比为1:40 g/mL，提取时间为45 min。

表3 方差分析表

2.4 体外抗氧化试验结果

2.4.1 DPPH自由基清除能力测定结果 由表4可以看出，在一定浓度下，天麻多糖对DPPH自由基的清除率随着天麻多糖溶液浓度的增大而逐渐提高，当天麻多糖溶液浓度变为3.5 mg/mL时，天麻多糖粗提物的清除率达到38.63%，天麻多糖的清除率达到40.52%，说明天麻多糖含量在一定范围内有良好的清除DPPH自由基的效果。

表4 DPPH自由基清除能力结果

2.4.2 清除羟基自由基能力测定结果 由表5可得，在一定浓度下，随着天麻多糖溶液浓度的增大，其羟基自由基清除效果也随之增强，当天麻多糖溶液浓度变为3.5 mg/mL时，天麻多糖粗提物的清除率最高达到30.36%，天麻多糖的清除率能达到36.52%。说明天麻多糖含量在一定范围内有良好的清除羟基自由基的效果。

表5 羟基自由基清除能力测定结果

3 讨论与结论

本试验采用热水浸提法并以超声波粉碎进行辅助，通过单因素分析法设计L9(34)正交试验。试验结果表明，当超声时间为45 min、液料比为1:40 g/mL、提取温度为65℃时，天麻多糖的含量最高，可达32.83 mg/g，远高于采用回流醇沉法提取的云南昭通天麻多糖含量(25.04 mg/g)、陕西略阳天麻多糖含量(23.46 mg/g)、四川汶川天麻多糖含量(23.41 mg/g)、贵州青龙天麻多糖含量(20.67 mg/g)、湖北神农架天麻多糖含量(20.28 mg/g)[29]，但略低于同样采用超声波辅助法提取的贵州省德江天麻多糖含量(33.4 mg/g)[30]，这说明在合适的工艺条件下，超声波辅助热水浸提法可显著优化商洛天麻多糖的提取工艺。

本试验分别采用DPPH法和Feton体系法测定天麻多糖的DPPH自由基和羟基自由基的清除效率，并以此分析判断天麻多糖的体外抗氧化活性能力。其试验结果显示，天麻多糖对DPPH自由基和羟基自由基具有一定的清除作用，且清除能力与浓度成正比。当天麻多糖溶液浓度为3.5 mg/mL时，其对DPPH自由基和羟基自由基分别达到40.52%和36.52%，这说明天麻多糖具有良好的体外抗氧化能力。但这个结果略低于陈琛采用酶提法提取的天麻多糖的体外抗氧化指标（DPPH自由基44.5%，羟基自由基39.5%）[31]。这可能是因为多糖的生物活性与其结构性质具有一定的相关性，而本试验中的超声波处理和加热导致多糖的部分糖链断裂，进而改变了部分多糖的结构和分子量，影响了其体外抗氧化活性[32]。

综上所述，与热水浸提法、酶提法及回流醇沉法等方法相比，超声波辅助热水浸提法可显著提升商洛产天麻的多糖提取率，达32.83 mg/g。另外，本方法提取的天麻多糖具有一定的体外抗氧化活性，当溶液浓度为3.5 mg/mL时，其对DPPH自由基和羟基自由基分别达到40.52%和36.52%。