房佳敏，马成瑶，张彦龙

（1黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨150080；2黑龙江大学/农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨150500）

0 引言

黑木耳是一种药食性的同源真菌，最早被记载于《神农本草经》，具有清肺润肠、活血化瘀、明目养胃等功效[1]。黑木耳不但美味可口，还含有大量的多糖[2]、碳水化合物、腺苷类物质[3]、氨基酸、木耳黑色素[4]、微量维生素等。黑木耳多糖是黑木耳研究中最主要的化学成分之一，也是目前报道最多的成分，然而凝集素却未见详细的阐述。凝集素是一类从植物、高等动物、无脊椎动物中提纯的糖蛋白或结合蛋白，因能凝集红血球，称为凝集素[5]。研究发现凝集素在抑菌、抗肿瘤[6]、免疫调节[7]都具有不容小觑的作用。早期学者们对植物中的凝集素研究较为深入，慢慢地转为对动物以及海洋无脊椎动物的研究。现阶段随着凝集素的深入研究，人们将目光投入到食用菌身上。Ram等[8]在巴拿马曲霉菌的菌丝中提取到分子量约为78 kDa的二聚体凝集素，此凝集素对金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌具有抑制作用。Wang等[9]从双孢子蘑菇中发现凝集素样蛋白LSMT，该凝集素样蛋白和水粉杯伞Ricin-B样凝集素、肉毒杆菌HA-33极其吻合，LSMT可以渗透小鼠的上皮透析管，但却不参与免疫应答。本实验就是从黑木耳体内分离得到一种可以促使RAW264.7细胞产生细胞因子的凝集素，探讨黑木耳凝集素的免疫调节作用。

巨噬细胞属于免疫细胞，当上皮细胞屏障抵御病原菌感染后，巨噬细胞是防御的第一道防线，由于病原微生物侵害机体时会出现病理性的变化，巨噬细胞通过识别抗原表面的受体，活化后促进吞噬的能力，从而清除病原体[10]。在不同的组织中巨噬细胞以不同的方式存在，通常可以分泌多种细胞因子，并且在应对炎症反应、修复组织损伤中都发挥着重要的作用[11]。RAW264.7细胞用于巨噬细胞免疫调节常用细胞模型。本实验选取鼠的巨噬细胞RAW264.7细胞为研究对象。黑木耳凝集素在免疫调节方面并没有系统研究，尤其是对RAW264.7细胞的作用没有报道。笔者主要探索黑木耳凝集素在免疫调节方面的作用，旨在为进一步开发黑木耳凝集素的活性研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验时间、地点

实验于2019年12月—2020年3月在黑龙江大学生命科学学院微生物重点实验室进行。

1.2 材料与仪器

黑木耳采自于黑龙江勃利县，鼠巨噬细胞RAW264.7细胞系购自上海中科院细胞库。猪胃黏蛋白PSM来自于美国Sigma-Aldrich公司，考马斯亮来自美国Amresco公司，无菌脱纤维兔血(HQ50073)购自广州鸿泉生物科技有限公司，RPMI 1640培养基购自于美国Hyclone公司，ELISA试剂盒来自美国昂飞affymetrix aBioscience公司，NO试剂盒购置北京碧云天公司。

GE AKTA Purifier蛋白纯化仪（美国-GE），冷冻干燥机（北京博益康实验仪器有限公司），高速冷冻离心机（美国ThermoFisher），二氧化碳培养箱（美国ThermoFisher），倒置显微镜（D10日本），生化净化工作台（BCM-1000上海玻璃仪器厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 黑木耳凝集素的提取 在搅拌器中加入10 g冻干后的鲜黑木耳，倒入400 mL 10 mmol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)搅拌至匀浆，3000 r/min离心30 min，取上清液4℃保存。将黑木耳匀浆用40%(NH4)2SO4沉淀，在4℃下静置过夜。8000 r/min4℃离心20 min称取沉淀。将沉淀用少量的PBS溶解后，4℃透析冻干，得到凝集素粗提物。取凝集素粗提物溶解后，9000 r/min 4℃离心15 min，将上清液与猪胃黏蛋白-琼脂糖4B(PSM-Sepharose)在4℃结合2 h，结合后用pH 3.0的甘氨酸进行洗脱。使用AKTA蛋白纯化系统观察和收集洗脱物，最终分离纯化黑木耳凝集(LAA)[12]，其纯度用SDS-PAGE电泳检测。

1.3.2 SDS-PAGE电泳纯度鉴定 取黑木耳凝集素(LAA)配制成0.5 mg/mL的溶液。配置12%分离胶、5%浓缩胶，经配胶、上样、电泳、考马斯亮蓝的染色及脱色。最后观察SDS-PAGE图，判断黑木耳凝集素(LAA)的纯度和分子量。

1.3.3 黑木耳凝集素凝血活性检测 将黑木耳凝集素配成500 μg/mL溶液，按照2倍稀释，每孔加入30 μL凝集素后，再分别加入30 μL提前配制好的2%新鲜兔血红细胞悬液。室温静置2 h后观察结果。

1.3.4 黑木耳凝集氨基酸组分检测 参照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》[13]的方法对黑木耳凝集素中氨基酸进行测定。准确称取黑木耳凝集素样品，加6 mL盐酸在110℃下水解21 h。将样品水解溶液冷却后、定容。取2 mL进行过滤，过滤后水解液用旋蒸仪45℃蒸干，用2 mL纯水溶解后再次蒸干，最后用盐酸溶解、过滤、检测分析。

1.3.5 RAW264.7细胞培养 将RAW264.7细胞放置于RPMI1640培养基和DMEM高糖培养基中，37℃下在湿润的CO2培养箱中（5% CO2，95%空气）培养。

1.3.6 细胞炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的测定 将96孔板中加入密度为5×105个细胞/mL的RAW264.7细胞过夜，之后以不同浓度的黑木耳凝集素LAA(1、5、10 μg/mL)处理细胞，未加样处理的为阴性对照组。将处理好的细胞放置于CO2培养箱中37℃、5% CO2条件下培育24 h。收集无细胞上清液后ELISA试剂盒；测定IL-6、IL-1β、TNF-α的浓度[14]。试剂盒的具体操作参照说明书。

1.3.7 NO测定 采用Green等[14]的方法产NO，由细胞上清液形成的亚硝酸盐水平，通过Griess试剂比色法测定NO水平[15]。在96孔板中将RAW264.7细胞以密度5×105个细胞/mL接种培养24 h。之后以不同浓度的黑木耳凝集素LAA(1、5、10 μg/mL)处理细胞，未加任何处理的为阴性对照组。加药处理后，放置于CO2培养箱中37℃、5% CO2条件下培育24 h。收集细胞上清液后，根据Griess试剂比色法，通过碧云天NO试剂盒测定NO水平。试剂盒的具体操作参照说明书。

1.3.8 数据处理 实验数据均重复3次，以xˉ±s形式呈现。采用GraphPad Prism 6.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，各组之间采用Fisher’s LSD test进行多重比较分析，*P＜0.05、***P＜0.001表示显著性差异。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE电泳纯度鉴定结果

对黑木耳凝集素LAA进行SDS-PAGE电泳实验，结果如图1所示。图中只有一条单一的条带，并且在15k～25 kDa，所以初步推测黑木耳凝集素LAA分子量约为20 kDa。

图1 SDS-PAGE电泳纯度鉴定结果

2.2 黑木耳凝集素凝血活性检测结果

黑木耳凝集素LAA的凝血活性结果如图2所示，从图中可以看出，黑木耳凝集素LAA粗品中最小凝血浓度为62.5 μg/mL。然而纯化后的黑木耳凝集素LAA中最小凝血浓度为3.9 μg/mL。所以纯化的粗品与未纯化的相比，其凝血活性显著增加。

图2 黑木耳凝集素凝血活性测定

2.3 黑木耳凝集氨基酸组分检测结果

将纯化的黑木耳凝集素LAA用酸水解，水解后用全自动氨基酸分析仪检测氨基酸的组成（由于氨基酸酸水解可以破坏色氨酸，所以未检测色氨酸含量）。从表1中可以看出，黑木耳凝集素LAA共含有14种氨基酸，5种为必需氨基酸。根据氨基酸的酸碱性划分，黑木耳凝集素LAA酸性氨基酸所占的比例较大，其中天冬氨酸、谷氨酸分别为11.83%、13.46%。然而黑木耳凝集素LAA碱性氨基酸所占比例较小，赖氨酸、组氨酸和精氨酸含量分别为2.03%、3.14%、2.42%。

表1 黑木耳凝集素LAA的氨基酸组成

2.4 黑木耳凝集素LAA对RAW264.7细胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α的影响

不同浓度的黑木耳凝集素LAA和RAW264.7细胞共培养24 h后，检测IL-6、IL-1β和TNF-α的表达量，阳性对照组为脂多糖LPS。与空白对照组相比，黑木耳凝集素LAA在1 μg/mL时RAW264.7细胞分泌IL-6有显著性的差异，当黑木耳凝集素LAA在5、10 μg/mL浓度下可以显著提高RAW264.7分泌IL-6的水平（图3）。对于RAW264.7细胞分泌IL-1β的表达量，与空白对照组相比，当黑木耳凝集素LAA在5 μg/mL时，IL-1β开始出现显著的差异（图4）。而当黑木耳凝集素LAA处理RAW264.7细胞24 h后，与空白组比较，黑木耳凝集素LAA在1 μg/mL时，TNF-α的分泌水平有显著差异，在5 μg/mL时能显著提高TNF-α的分泌水平（图5）。

图3 黑木耳凝集素LAA对RAW264.7细胞产生IL-6的影响

图4 黑木耳凝集素LAA对RAW264.7细胞产生IL-1β的影响

图5 LAA对RAW264.7细胞产生TNF-α的影响

通过上述实验结果可知，与空白组相比，随着黑木耳凝集素浓度的增加，刺激RAW264.7细胞分泌细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的效果加强，且随着黑木耳浓度的增加，IL-6、IL-1β和TNF-α的释放量呈现依赖效果，因此黑木耳凝集素具有免疫调节的作用。

2.5 黑木耳凝集素LAA对RAW264.7细胞分泌NO的影响

黑木耳凝集素LAA以不同浓度和RAW264.7细胞共培养24 h后检测NO的表达量。与空白对照组相比，随着黑木耳凝集素浓度的升高，RAW264.7细胞释放的NO升高，NO的释放量与黑木耳凝集素呈现出一种浓度依赖关系。黑木耳凝集素LAA在1 μg/mL时RAW264.7细胞产生的NO，与空白对照组相比差异不显著。当浓度达到5 μg/mL时，RAW264.7细胞分泌NO出现显著差异（图6）。

图6 黑木耳凝集素LAA对RAW264.7细胞产生NO的影响

3 结论与讨论

近年来，科学工作者们相继在食用菌中提取凝集素，食用菌凝集素所具有的糖结合结构域特异性与单糖或糖复合体结合，可以有效地识别并凝集细胞，使细胞停留在分裂间期，从而限制肿瘤细胞的生长及发挥免疫调节的作用[16]。早期的研究学者就发现，双孢蘑菇、金针菇等食用菌中含有特殊的蛋白及糖组分，可以刺激、激活免疫效应细胞，从而促进人外周单核细胞产生的细胞因子，完成免疫应答。姬松茸[17]的研究发现，姬松茸可以刺激T细胞上的树突状细胞，从而使CLRs凝集素受体激活T细胞完成内吞过程，分泌细胞因子TNF-α，实现免疫调节的作用。在相关的实验报道中，食用菌凝集素通过佐剂的使用发挥免疫调节的作用得到证实。Maria[18]等发现了茶树菇凝集素上的糖识别结构域可以与禽流感表面糖基化蛋白、神经氨酶和血凝素相结合，抗体的表达量显著提升，因此茶树菇凝集素作为免疫佐剂在对抗禽流感病毒中明显增强了疫苗的免疫应答活性。本研究介绍了巨噬细胞RAW264.7在不同浓度的黑木耳凝集素LAA刺激下会产生免疫应答，合成并释放细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和NO，从而对抗外界病菌的侵扰。

本研究分离黑木耳凝集素LAA主要利用饱和度为40%的(NH4)2SO4沉淀法，并伴随凝血活性检测、氨基酸成分测定，最后进行SDS-PAGE电泳实验。根据电泳图谱分析，初步确定黑木耳凝集素LAA分子量约为20 kDa。巨噬细胞RAW264.7通过吞噬病原微生物、分泌细胞因子、水解蛋白和呈递抗原，在机体的防御中发挥不可或缺的作用[19]。活化的巨噬细胞可以杀死病原微生物，通过分泌IL-6、IL-1β、TNF-α和NO等其他免疫活性因子参与、调控免疫防御和免疫调节[20]。黑木耳凝集素LAA可以促进巨噬细胞RAW264.7分泌细胞因子，细胞因子的表达和调控不是独立存在的，需要相互作用、相互协调[21]。结果显示，TNF-α的释放量与黑木耳凝集素的浓度存在一定的依赖关系。TNF-α可以介导天然性、获得性免疫，激活免疫的细胞。TNF-α也可以促进CTL的活化、增殖和分化[22]。根据功能的特性和产生免疫应答的不同分为Th1或Th2，巨噬细胞分为M1、M2型。IL-6为M1型巨噬细胞标志性的细胞因子，IL-6同时具有促炎和抗炎的功效。IL-6通过诱导成熟的CD4+T细胞分化为Th2细胞，促进B细胞对免疫球蛋白的分泌。IL-1β是一种重要的细胞因子，通过诱导环氧合酶-2的产生达到增强粘附分子表达的能力[23]。黑木耳凝集素LAA可以作为一种介导，刺激RAW264.7细胞分泌IL-1β。通过观察黑木耳凝集素LAA处理的RAW264.7细胞，发现NO的释放量与黑木耳凝集素LAA的浓度呈现依赖性。NO被认为是免疫药理学中关键的分子，并对参与免疫调节、炎症等生理过程的细胞产生有益的生物学效应[24]。本实验只检测了黑木耳凝集素对炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和NO的分泌，在今后的研究中可以检测黑木耳凝集素对iNOS、COX-2蛋白的分泌量以及检测是否存在LPS的干扰。也可以探讨黑木耳凝集素是否会通过MAPK通路和NF-kB通路诱导NO的表达。由此可见，黑木耳凝集素对于巨噬细胞RAW264.7免疫功能调节作用包含多个方面，是一个十分复杂的过程。

综上所述，黑木耳凝集素LAA可以显著增强巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力，并刺激细胞产生IL-6、IL-1β、TNF-α和NO的分泌（与空白组实验比较）。实验结果显示，黑木耳凝集素LAA能够显著提高细胞因子的分泌量，增强巨噬细胞RAW264.7的免疫活性，说明黑木耳凝集素LAA具有一定的免疫刺激活性。