刘 晔，刘 斌

（1.靖边县人民医院检验科，陕西靖边 718500; 2. 靖边县中医医院检验科）

结肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球居第3位[1]。研究发现肿瘤发生率在慢性炎症部位较非炎症部位明显增高，并且在炎症组织中过表达的细胞因子已被证实可诱导肿瘤的发生发展。IL-6可直接通过结合于细胞表面的相应受体从而促进细胞内的STAT3活化，激活后的STAT3信号通路可促进肿瘤的发生与发展[2]。苦参碱是临床上一种常用中药，不仅具有抗病毒和抗心律失常等作用，相关研究发现其还具有一定的抗肿瘤作用，但其用于治疗结肠癌的研究报道较少，作用机制有待进一步深入研究。本文通过使用苦参碱干预人结肠癌细胞HCT-116，使用细胞增殖实验CCK-8检测细胞增殖力，Western blot实验检测炎性因子IL-6/STAT3基因蛋白表达水平以及结肠癌细胞转移力E-Cad基因蛋白表达水平，以探讨苦参碱对HCT-116细胞增殖力、转移力的影响，为后续深入研究提供理论基础。

1 材料

一抗IL-6、STAT3、E-Cad及β-actin购自Proteintech公司，二抗购自中山金桥公司。蛋白提取试剂盒购自凯基生物公司，CCK-8细胞活力检测试剂盒购自北京全式金生物公司。Western Blot曝光仪购自AZURE公司，酶标仪购自bio-rad公司。

2 方法

2.1 CCK-8实验测定苦参碱对HCT-116细胞的影响

将HCT-116细胞接种于细胞培养皿内培养，等到细胞生长状态良好时，消化细胞接后种于96孔板内，培养12h后加入含苦参碱细胞培养液继续培养，苦参碱浓度梯度依次为0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4（mg/mL），继续在5%CO2细胞培养箱内培养4h，弃掉原培养液，加入不含血清的细胞培养液，同时加入CCK-8检测试剂，开始测定吸光度值并记录实验结果。

2.2 Western blot 检测IL-6/STAT3蛋白表达变化

将HCT-116细胞接种于细胞培养皿内培养，培养12h，加入含苦参碱的细胞培养作用4h后吸掉换入新鲜培养基（浓度依次为2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL），继续培养12h后收取细胞并提取蛋白。加样开始电泳，结束后开始转膜，条件为300mA 30～50min，待封闭完成后分别放入一抗（IL-6/STAT3/E-Cad/β-actin）中室温孵2～4h，洗膜后放入二抗（1:4000）中室温孵育1～2h，洗膜后加入发光液采集图像，保存数据。

2.3 统计分析

使用SPSS 19.0分析试验数据，使用GraphPad Prism5.0作图。原始数据符合正态分布，同时满足方差齐性，则使用t检验或方差分析，P＜0.05提示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 苦参碱对结肠癌细胞增殖力的影响

使用不同浓度含苦参碱培养基干预HCT-116细胞，结果如图1所示，当苦参碱浓度为2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL时干预HCT-116细胞4h，均能够较好的抑制HCT-116细胞的增殖。

图1 苦参碱干预HCT-116细胞活力测定

3.2 Western blot 检测IL-6/STAT3蛋白表达水平

使用2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL的苦参碱干预细胞4h后继续培养12h，提取蛋白通过Western blot 检测IL-6、STAT3、E-Cad蛋白表达，结果提示苦参碱干预组（MA2/3/4组）较对照组（CON组）IL-6/STAT3蛋白表达量明显降低（P＜0.05），E-Cad蛋白表达量明显升高（P＜0.05），如图2：

图2 苦参碱干预HCT-116 IL-6/STAT3蛋白表达水平

4 讨论

近年来，结肠癌的发病率及死亡率呈现上升趋势，据统计，其5年生存率仅约50%[4,5]。研究发现，在慢性炎症部位的肿瘤发生率较非炎症部位明显增高，并且在炎症组织中过表达的细胞因子已被证实可诱导肿瘤的发生发展。肿瘤组织发生发展过程中，经常伴有炎症介质并且呈持续性浸润。研究报道，炎症细胞及相关因子在肿瘤的发展过程中，IL-6是其共同作用的靶分子[6,7]。IL-6是一种多功能的细胞因子，可介导免疫和炎症反应[8]。Grivennikov等[9]研究发现，IL-6参与肿瘤增殖及凋亡过程并起到非常重要的作用，IL-6一方面促进肿瘤细胞增殖，另一方面抑制肿瘤细胞凋亡。IL-6通过结合靶细胞表面的sIL-6R，形成复合物进而促进靶细胞表面的gp130的激活，进一步激活JAK活化酪氨酸激酶，从而结合STAT3蛋白。当STAT3被活化后可以进入靶细胞的细胞核，从而触发靶基因的转录和表达，调控肿瘤细胞增殖及凋亡[10]。IL-6/STAT3在肿瘤组织发生发展中起到非常重要的作用，IL-6/STAT3在部分肿瘤组织中可促进其增殖、抑制其凋亡，抑制或阻断IL-6/STAT3已成为当前治疗肿瘤较为热门的科研方向[11]。

苦参碱是临床上一种常用中药，具有较强的抗肿瘤作用，研究表明苦参碱可抑制肿瘤细胞的增殖，对白血病、肝癌和胃癌都有较好的疗效，同时由于其毒副作用小，有可能发展成为很好的抗肿瘤药物[12]。张伟[13]研究了不同浓度苦参碱对人急性淋巴细胞白血病侵袭转移的抑制作用，发现苦参碱能全面抑制白血病细胞的粘附能力、运动能力和侵袭能力。有研究发现，在肿瘤的发生、发展过程中，苦参碱可抑制JAK－STAT信号转导通路，抑制肝癌细胞增殖[2]。这些研究表明，苦参碱在抗肿瘤过程中有IL-6/STAT参与，并且起到重要作用。

本研究通过使用中药苦参碱干预人结肠细胞HCT-116，使用CCK-8技术检测细胞增殖力变化，使用Western blot检测IL-6/STAT3以及肿瘤侵袭转移因子E-Cad的变化情况，实验结果提示，苦参碱浓度在2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL能够较好的抑制人结肠细胞HCT-116的增殖力。使用上述浓度的苦参碱干预人结肠细胞HCT-116后，炎症因子IL-6/STAT3蛋白表达量MA2/3/4组较CON组明显降低，E-Cad明显升高，提示苦参碱可以有效抑制结肠癌细胞增殖，抑制IL-6/STAT3蛋白表达，降低炎症反应，促进E-Cad蛋白表达，从而降低肿瘤细胞的侵袭转移能力，达到抗肿瘤作用。本研究结果显示苦参碱具有明显的抗炎症和抗肿瘤效果，并初步探讨了抗炎与抗肿瘤之间的联系，发现IL-6/STAT3信号通路是炎症与肿瘤之间较为重要的桥梁之一，为后续深入研究提供理论基础。

综上所述，苦参碱可通过降低炎性反应，降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力，抑制肿瘤增殖，来达到良好的抗肿瘤作用。