张雪丹 ，刘 涛 ，杨娟侠 ，王 丹 ，范 昆 ，张 倩 ，辛 力 ,*

（1.山东省果树研究所，山东 泰安 271000；2.中华人民共和国黄岛海关，山东 青岛 266555）

蓝莓（Vaccinium corymbosum L.）又名蓝浆果、越橘，为杜鹃花科越橘属植物，其果肉细腻、肉软多汁、色泽美丽，富含花色苷等营养成分和抗氧化物质，具有很高的营养保健和经济价值[1-2]。虽然蓝莓果实pH较低，但因采摘时果蒂部位的伤口易受病菌感染，且采收多在高温高湿季节，果实呼吸速率高，导致蓝莓果实腐烂而不耐贮藏，20 ℃下贮藏期仅为一周左右，这限制了蓝莓跨地域、长时间、高质量的流通和销售[3-4]。随着我国蓝莓栽培面积的不断扩大和果实产量的持续升高，人们对蓝莓鲜果采后品质提出了更高的要求，不仅要保持较好的食用品质和较长的保鲜货架期，还需保证其食用安全性。

咯菌腈（Fludioxonil，FL）是一种低风险的广谱杀菌剂，属于苯基吡咯家族，主要抑制灰霉菌和青霉菌的菌丝生长和孢子萌发[5]。目前，咯菌腈已成为先正达、拜耳和孟山都等企业生产的30 多种不同农药的主要成分，获准应用于900 多种农产品上[6]。研究表明，该杀菌剂可显著降低柠檬[7]、石榴[8]、芒果[9]、樱桃[10]等果品贮藏保鲜的腐烂率，延长果品贮藏保鲜期的同时保持了果实品质，因此咯菌腈在果品采后贮藏保鲜领域有广阔的应用前景。但有研究表明，咯菌腈可能会对神经系统产生负面影响从而影响人类健康[11]，因此各国均对咯菌腈的应用范围和作用物最大残留量做出严格的规定。

目前，咯菌腈主要用于蓝莓栽培中各种病害的防治上[12-13]，未见有咯菌腈用于蓝莓采后贮藏保鲜的研究。本文以“莱格西”（Legacy）蓝莓为试材，研究咯菌腈浸泡处理对采后常温保鲜蓝莓的咯菌腈残留量、腐烂率、失重率、呼吸速率、乙烯生成速率、可溶性固形物、可滴定酸和花青苷含量等的影响，综合评价咯菌腈用于蓝莓采后贮藏保鲜的安全性和可行性，旨在为蓝莓采后贮藏保鲜提供新的途径和理论依据，为果蔬采后贮藏保鲜提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

蓝莓品种为野生蓝莓和高灌蓝莓的杂交后代“莱格西”（Legacy），采自山东省泰安市岱岳区方泰旭瑞农业科技开发有限公司，果园为6 年生标准化蓝莓园。2019 年 6 月 24 日早上采摘 8～9 成熟果，当天上午运至实验室，去除霉烂、虫害、凹陷、畸形等非商品果，挑选大小、色泽一致的果实备用。

50%咯菌腈（粉剂）：先正达生物科技有限公司产品；乙腈、硫酸镁、柠檬酸、氯化钾、乙酸钠、盐酸、甲醇等均为分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司产品。

1.1.2 仪器与设备

Agilent1260 高相液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；WY032T 型手持测糖仪，西安精大检测设备有限公司；F-950 型手持式乙烯测量仪，北京阳光亿事达科技有限公司；ML-204 型电子天平，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；UV-2100 型紫外可见分光光度计，瑞典Amersham Biosciences 公司；5810R型高速离心机，艾本德（上海）国际贸易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 处理方法

对照（CK）：蓝莓在去离子水中浸泡处理10 s，然后捞出沥干（果面无水分），装入打孔塑料盒内，每盒200 粒，置于20 ℃恒温箱内贮藏，共30 个重复。分别于贮藏 0、2、4、6、8 d 取样，每次取样 6 盒。

咯菌腈处理（100 mg/kg FL）：果实置于100 mg/kg的咯菌腈溶液中浸泡处理10 s，然后捞出沥干（果面无水分），装入打孔塑料盒，每盒200 粒，置于20 ℃恒温箱内贮藏，共 30 个重复。放置 0、2、4、6、8 d 取样，每次取样6 盒。

1.2.2 测定项目与方法

1.2.2.1 咯菌腈残留量

样品前处理参考秦富等[14]的方法，并稍有改动。称取3.0 g 蓝莓样品，加入20 mL 乙腈冰浴研磨，然后加入助剂硫酸镁（4 g）和柠檬酸（1 g）并混合振荡30 min。经4 000 r/min 离心5 min，取上清液加入无水硫酸镁和N-丙基乙二胺混匀，再次离心，上清液为制备待测液。色谱柱为C18 柱，波长270 nm，流动相为水和乙腈。

1.2.2.2 腐烂率

果实表面发生汁液外漏或有肉眼可见腐烂斑点即为腐烂果，统计每盒蓝莓的腐烂果数，根据下列公式计算腐烂率：

1.2.2.3 失重率

称取每个保鲜盒内蓝莓果实的质量m0，常温放置2 d 后果实质量为m2，根据下列公式计算常温放置2 d 的失重率，以此类推分别称量并计算保鲜4、6、8 d的果实失重率。

1.2.2.4 呼吸速率和乙烯生成速率

使用F-950 型手持式乙烯测量仪测定密封容器内蓝莓果实的呼吸速率和乙烯生成速率[15-16]，其中呼吸速率以每小时每千克蓝莓果实产生的CO2量（mg）表示，乙烯生成速率以每小时每千克蓝莓果实产生的乙烯体积量（μL）表示。

1.2.2.5 可溶性固形物含量

将蓝莓果实打浆并迅速吸取上清液2～3 滴涂在手持测糖仪上，测定可溶性固形物含量。

1.2.2.6 可滴定酸（TA）含量

采用酸碱滴定法测定，称取10 g 果实用石英砂研磨匀浆并加蒸馏水30 mL 转移至三角瓶内，过滤；取滤液10 mL，加入3 滴酚酞，用 0.1 mol/L NaOH 滴至溶液微红转白色，30 s 不褪色即为滴定终点，记录消耗的NaOH 用量。可滴定酸含量的计算公式如下所示，以果实中的苹果酸含量表示。

式中：K 为苹果酸换算系数 0.067；A 为消耗NaOH量，mL；C 为稀释总量；W 为样品质量，g；D 为测定取样量，mL。

1.2.2.7 花青素含量

参考Lin 等[17]的双波长pH 示差法，并稍有改动。称取3 g 蓝莓组织研磨，加入酸性甲醇（0.1% HCl）30 mL，在 45 ℃水浴锅中提取 45 min，离心（6 000 r/min，10 min），取上清液。沉淀中加入酸性甲醇30 mL，再次提取、离心、合并上清液，重复两次，提取的3次上清液为花青素粗提液。吸取1 mL 上述提取液，分别加入9 mL 的0.025 mol/L 氯化钾缓冲液（pH 1.0）和0.4 mol/L 乙酸钠缓冲液（pH 4.5）稀释，平衡15 min，然后分别在 515 nm 和 700 nm 处测定每种稀释液对蒸馏水的吸光度值。根据下列公式计算花青素含量，结果以100 g 果实中所含有的矢车菊-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucoside）的量（mg）表示：

式中：ΔA 为pH 1.0 测试液在波长515 nm 和700 nm处吸光度的差减去pH 4.5 测试液在波长515 nm和700 nm 处吸光度的差；MW 为矢车菊-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；DF 为稀释因子；ε 为矢车菊-3-葡萄糖苷的消光系数，29 600；L 是光程厘米数，1 cm。

1.2.3 数据处理

数据统计分析和作图使用GraphPad Prism 7 软件，显著性分析使用SPSS 19.0 软件。每个处理6 个重复，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 咯菌腈残留量分析

为评价咯菌腈用于蓝莓采后贮藏保鲜的食用安全性，课题组采用HPLC 法对咯菌腈溶液浸泡处理后的蓝莓果实咯菌腈残留量进行了测定。研究发现，经100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡处理10 s 后，蓝莓果实中咯菌腈残留量为（1.91±0.05）mg/kg（图 1）。

图1 HPLC 法测定蓝莓中的咯菌腈残留量Fig.1 The determination of fludioxonil residue level in blueberries by HPLC

2.2 咯菌腈处理对蓝莓果实腐烂率的影响

腐烂率不仅影响果品的食用品质，还会影响果品的商品价值。为评价咯菌腈处理抑制蓝莓腐烂率的效果，开展了腐烂率调查试验，结果见图2。在20 ℃贮藏条件下，咯菌腈处理可以降低蓝莓腐烂率。常温放置8 d，100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡10 s 处理果腐烂率为4.19%±0.53%，极显著低于对照蓝莓果的腐烂率（P＜0.01）。这是因为造成本地蓝莓腐烂的主要病菌为灰霉菌[18]，而咯菌腈可以抑制灰霉菌菌丝生长和孢子萌发，因此可以有效降低蓝莓的腐烂率。

图2 咯菌腈处理对常温贮藏期间蓝莓果实腐烂率的影响Fig.2 Effect of fludioxonil treatment on decay rates of blueberry fruits during room temperature storage

2.3 咯菌腈处理对蓝莓失重率的影响

蓝莓果实商品性的丧失主要表现在两个方面，一是腐烂败坏，二是失水皱缩[19]。蓝莓采后呼吸作用造成有机物质的消耗和水分含量的下降，果实失重率增加。由图3 可知，蓝莓果实的失重率随贮藏时间的延长逐渐升高，而咯菌腈处理显著促进了失重率的增加（P＜0.05）。20 ℃贮藏 2 d 时，对照果和 100 mg/kg FL处理果的失重率分别为0.92%±0.06%和1.04%±0.07%；贮藏8 d 时，对照果和100 mg/kg FL 处理果的失重率分别为4.47%±0.24%和4.82%±0.15%。由此可知，咯菌腈处理增加了常温保鲜蓝莓期果实的失重率。

图3 咯菌腈处理对常温贮藏期间蓝莓果实失重率的影响Fig.3 Effect of fludioxonil treatment on weight lost rates of blueberry fruits during room temperature storage

2.4 咯菌腈处理对蓝莓呼吸速率和乙烯生成速率的影响

图4 咯菌腈处理对常温贮藏期间蓝莓果实呼吸速率的影响Fig.4 Effect of fludioxonil treatment on respiration rate of blueberry fruits during room temperature storage

图5 咯菌腈处理对常温贮藏期间蓝莓果实乙烯生成速率的影响Fig.5 Effect of fludioxonil treatment on ethylene production rate of blueberry fruits during room temperature storage

由图4、5 可知，随着贮藏时间的延长，蓝莓果实的呼吸速率和乙烯生成速率逐渐下降，但均保持中等呼吸速率和低乙烯生成速率的特性[20]。虽然100 mg/kg FL 处理果的呼吸速率在常温保鲜期均高于对照果，但两者无显著性差异。与呼吸速率相同，咯菌腈处理果的乙烯生成速率均高于对照果。且在常温贮藏2 d 时，100 mg/kg FL 处理果的乙烯生成速率显著高于对照（P＜0.05），即100 mg/kg 咯菌腈处理显著促进了果实的乙烯生成速率。这种促进作用可以提高蓝莓抗病酶的活性，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）等[21]，从而降低果实的腐烂率和衰老程度。

值得注意的是，常温贮藏期“莱格西”蓝莓的呼吸速率和乙烯生成速率的下降趋势相同，这可能与“莱格西”蓝莓属于高丛蓝莓有关，即高丛蓝莓的呼吸速率和乙烯含量在成熟期达到峰值，采后贮藏期间逐渐下降[22]。与对照果实相比，咯菌腈处理果实一直保持较高的呼吸速率（CO2生成速率）和乙烯生成速率，这可能是造成咯菌腈处理果实失重率较高的主要原因。

2.5 咯菌腈处理对蓝莓可溶性固形物和可滴定酸含量的影响

果实的可溶性固形物和可滴定酸含量决定了其食用时的口感和可接受程度。由表1 可知，随着常温贮藏时间的延长，蓝莓的可溶性固形物含量先降低后升高。常温贮藏8 d 时，100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡10 s处理蓝莓果实的可溶性固形物含量达到最高，为14.72%±0.14%，但与CK 相比无显著性差异。蓝莓的可滴定酸含量则呈现逐渐下降的趋势，但CK和100 mg/kg FL 处理果的可滴定酸含量均无显著性差异，即100 mg/kg 咯菌腈处理果不会影响蓝莓的可滴定酸含量。综上所述，100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡10 s 处理不会影响蓝莓的食用品质。

表1 常温贮藏期间蓝莓果实可溶性固形物和可滴定酸含量的变化Table 1 The contents of soluble solids and titration acid of blueberries storaged at room temperature

2.6 咯菌腈处理对蓝莓花青素含量的影响

蓝莓果实富含花青素，具有较强的抗氧化性和较高的保健价值[23]。由图6 可见，蓝莓花青素含量随着常温贮藏时间的延长而逐渐升高，贮藏4～8 d，100 mg/kg FL 处理果的花青素含量显著高于对照（P＜0.05）。常温贮藏 8 d 时，100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡10 s 处理果的花青素含量为（24.44±0.58）mg/100 g FW，显著高于对照果（P＜0.05）。

图6 咯菌腈处理对常温贮藏期间蓝莓果实花青素含量变化的影响Fig.6 Effect of fludioxonil treatment on anthocyanin content of blueberry fruits during room temperature storage

3 讨论与结论

前期研究发现，果实咯菌腈的残留量与咯菌腈浸泡后的处理方式有很大关系[24-25]。本课题组开展了咯菌腈溶液浸泡后再用水冲洗对咯菌腈残留量的影响研究。结果表明，蓝莓经100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡处理10 s 后再用水冲洗5 min，咯菌腈的残留量为（0.76±0.03）mg/kg；蓝莓经 200 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡处理20 s 后再用水冲洗5 min 的咯菌腈残留量为（0.82±0.03）mg/kg。由此可知，蓝莓经咯菌腈溶液浸泡后再用水冲洗5 min 则可大大降低咯菌腈的残留量。值得注意的是，虽然用水冲洗可以降低蓝莓咯菌腈残留量，但处理的蓝莓腐烂率快速升高，因此不建议生产上先用高浓度咯菌腈溶液浸泡蓝莓后再用水冲洗蓝莓。

另外，咯菌腈残留量还与咯菌腈的品质状态有关，本试验中的咯菌腈为先正达公司生产的粉剂杀菌剂，200 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡处理20 s 后咯菌腈残留量为（2.97±0.16）mg/kg。而用另外一家公司生产的咯菌腈悬浮剂（50%）开展相同试验时，蓝莓中咯菌腈残留量为（6.63±0.39）mg/kg，且此处理的果实再用水冲洗5 min 后咯菌腈的残留量为（1.84±0.15）mg/kg。

国际上有多个国家允许咯菌腈用于果蔬采后贮藏保鲜领域，但对其用于蓝莓的最大残留量标准较少，仅有澳大利亚新西兰食品标准委员会2013 年将蓝莓中咯菌腈的最大残留量调整为1.0 mg/kg，低于其在鳞茎类蔬菜和鳄梨上的最大残留量[26]。美国、澳大利亚和新西兰规定核果类（桃、樱桃、杏等）中咯菌腈的最大残留量为5.0 mg/kg；加拿大规定叶菜类中咯菌腈的最大残留量为30 mg/kg，西红柿为5.0 mg/kg，豆类为0.4 mg/kg。2019 年5 月欧盟食品安全局拟将茴香中咯菌腈的最大残留量调整为1.5 mg/kg[27]。我国自 2020 年 2 月 15 日起实施的 GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[28]规定，蓝莓果实中咯菌腈的最大残留量为2.0 mg/kg，核果类水果的最大残留量为5.0 mg/kg。综合咯菌腈用于蓝莓采后处理的残留量结果，为保证果实的安全食用，建议咯菌腈用于蓝莓采后保鲜的处理浓度不高于100 mg/kg。

本试验以“莱格西”（Legacy）蓝莓为试材，研究咯菌腈浸泡处理对常温保鲜蓝莓的咯菌腈残留量、腐烂率、失重率、呼吸速率、乙烯生成速率、可溶性固形物、可滴定酸和花青素含量的影响。结果表明，采用100 mg/kg 咯菌腈浸泡10 s 的蓝莓果实咯菌腈残留量为（1.91±0.05）mg/kg，符合 GB 2763—2019 对于蓝莓咯菌腈的最大残留量标准。另外，该处理还显著降低了蓝莓果实的腐烂率，提高了果实的呼吸速率和乙烯生成速率，后期保持较高的可溶性固形物含量，并促进花青素的生成，但同时也促进了果实失水，具有较高的失重率。综上所述，100 mg/kg 咯菌腈浸泡10 s 处理蓝莓果实不仅可以使其残留量保持在较低水平，还具有降低蓝莓腐烂率和保持果实品质的作用。