谢雨婷 高军

海军军医大学第一附属医院消化内科，上海 200433

胰腺癌确诊困难，80%以上的患者确诊时已经是晚期，失去了手术治疗的机会。如果想提高胰腺癌患者的生存率，就必须提高患者的早期诊断率，因此寻找早期诊断指标，并为生物靶向治疗提供依据是胰腺癌研究的重点和难点[1-3]。DNA甲基化是影响基因活性的主要表观遗传因素[4]，抑癌基因启动子高甲基化被认为是癌症发生的重要原因[5]。基因组表型遗传修饰主要包括遗传物质DNA的甲基化修饰和核小体组蛋白修饰，结果是在DNA碱基不发生改变的情况下而表型却发生了变化。甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2，MeCP2)是能与甲基化DNA结合的一类核蛋白，可以将DNA甲基化和组蛋白修饰耦合起来，在表观遗传中发挥着中枢纽带的作用[6]。既往报道中，MeCP2与胃癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、骨肉瘤等多种肿瘤的发生和发展相关[7-8]，但在胰腺癌中的研究欠缺。本研究应用组织芯片，采用免疫组织化学染色法检测胰腺癌组织及其匹配的癌旁正常组织MeCP2的表达，分析MeCP2表达与胰腺癌病理参数及预后的相关性，为深入理解胰腺癌发生、发展提供新的思路。

材料与方法

一、MeCP2蛋白表达检测

组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司(产品批号：HPan-Ade120Sur-01)，芯片有63份胰腺癌组织，57份癌旁正常胰腺组织。常规切片后采用免疫组织化学染色法检测MeCP2蛋白表达。兔抗人MeCP2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。将组织芯片切片常规脱蜡至水，并经柠檬酸盐缓冲液煮沸进行抗原修复。经正常山羊血清封闭过夜后依次孵育MeCP2多克隆抗体和辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗。以DAB为底物显色后封片。选择组织结构清晰且染色均匀的胰腺癌组织芯片进行结果分析。免疫组织化学结果由2位病理科医师采用双盲法独立读片，并进行评分。每张标本在高倍镜下至少观察3个视野，按阳性细胞比例和染色强度进行病理学评分。阳性细胞比例≤1%为0分，2%～25%为1分，26%～50%为 2分，51%～<75%为3分，≥75%为4分；无染色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞比例评分与染色强度评分的乘积作为病理学评分，<4分为阴性(-)，≥4分为阳性(+)[7]。

二、临床资料

选择胰腺组织结构清晰且染色均匀的胰腺癌及癌旁正常胰腺组织芯片，共59例胰腺癌和53例癌旁正常胰腺组织入组。按MeCP2表达情况将芯片组织分为MeCP2阳性组和MeCP2阴性组。59例胰腺癌患者年龄43～81岁，中位年龄62岁，手术时间2009年1月至2013年8月，术前均未接受放、化疗或其他抗肿瘤辅助治疗。随访时间截至2014年11月。总生存期定义为从患者手术治疗日到患者死亡或者末次随访时间。患者死亡原因排除非胰腺癌的死亡。

三、统计学处理

结 果

一、胰腺癌及癌旁组织MeCP2表达及其与临床病理特征的相关性

59例胰腺癌组织中28例MeCP2阳性表达，31例MeCP2阴性表达，阳性表达率为47.5%；53例癌旁组织中36例MeCP2阳性表达，17例MeCP2阴性表达，阳性表达率为67.9%(图1)，癌旁组织的阳性表达率明显高于胰腺癌组织，差异有统计学意义(χ2=4.776，P=0.029)。

图1 胰腺癌组织(1A)及其癌旁组织(1B)中的MeCP2表达(免疫组织化学染色 ×100)

胰腺癌组织MeCP2阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、神经侵犯、临床分期均无显著相关性，但有淋巴结转移及病理Ⅲ级的胰腺癌组织MeCP2阳性表达例数明显少于阴性表达例数，而无淋巴结转移及病理Ⅱ级的胰腺癌组织MeCP2阳性表达例数明显多于阴性表达例数，差异均有统计学意义(表1)。

癌旁组织MeCP2阳性表达与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、淋巴结转移、神经侵犯均无显著相关性，但病理Ⅲ级胰腺癌的癌旁组织MeCP2阳性表达例数明显少于阴性表达例数，而病理Ⅱ级的癌旁组织MeCP2阳性表达例数明显多于阴性表达例数；临床4期的癌旁组织MeCP2阳性表达例数少于阴性表达例数，而临床2期的癌旁组织MeCP2阳性表达例数明显多于阴性表达例数，差异均有统计学意义(表1)。

表1 胰腺癌及癌旁组织MeCP2表达与临床病理参数的相关性(例)

二、胰腺癌患者的生存期及预后因素

胰腺癌组织MeCP2阴性、阳性表达患者的中位总生存期分别为8个月、10个月(95%CI7.125～10.875，图2)；癌旁组织MeCP2阴性、阳性表达患者的中位总生存期分别为8个月、10个月(95%CI7.224～10.776，图3)。无论是胰腺癌组织还是癌旁组织，MeCP2阳性表达患者的总生存期均显著长于阴性表达患者，差异均有统计学意义(P值分别为0.027、0.036)。Cox单因素分析结果显示，胰腺癌患者预后与胰腺癌及癌旁组织MeCP2的表达和病理分级相关，即胰腺癌组织MeCP2阳性表达患者的生存期较阴性表达患者明显延长，癌旁组织MeCP2阳性表达患者的生存期较阴性表达患者明显延长，病理Ⅱ级患者的生存期较病理Ⅲ级患者明显延长，差异均有统计学意义；但胰腺癌预后与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、淋巴结转移与否、神经侵犯与否、临床分期等因素无相关性(表2)。多因素分析结果显示，MeCP2在胰腺癌组织中的表达是胰腺癌患者预后评估的独立因素，阳性表达的患者预后较好(表3)。

图2 胰腺癌组织MeCP2表达阳性组与阴性组的总体生存曲线

图3 胰腺癌癌旁组织MeCP2表达阳性组与阴性组的总体生存曲线

表2 59例胰腺癌患者临床病理参数与患者预后的单因素分析

表3 59例胰腺癌患者临床病理参数与患者预后的多因素分析

讨 论

DNA甲基化是一种重要且与转录沉默有关的表观遗传修饰[9]，其对于DNA的精确调控至关重要[4]。MeCP2是与DNA甲基化密切相关的蛋白，在DNA甲基化中起着非常重要的作用，其功能依赖于识别和结合甲基化DNA的能力[9]。MeCP2是包含DNA甲基结合域的基础蛋白[10]，招募组蛋白脱乙酰基酶、甲基化酶等到甲基化DNA，从而导致转录抑制[11]。有研究表明MeCP2通过结合胰腺癌细胞的甲基化CpG岛来抑制胰腺癌细胞LIN28A的表达，而LIN28A的表达异常与人类肿瘤的发生和发展有关[12]，提示MeCP2可能有抑癌效应。

既往研究证实，MeCP2是一种染色质结合蛋白，可介导转录调控，在大脑中含量很高[13]。Rett综合征(RTT)是一种严重的进行性神经系统疾病，主要影响年轻女性，而MeCP2基因突变是经典RTT病例的最普遍原因[14]。MeCP2也与一些精神疾病相关，例如自闭症和精神分裂症[15]。现有研究发现MeCP2还与乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等肿瘤的发生和发展密切相关[16]。本研究结果显示，胰腺癌组织MeCP2阳性表达率明显高于癌旁组织，胰腺癌组织和癌旁组织MeCP2阳性表达患者的生存期较阴性患者长，说明MeCP2阴性则胰腺癌的侵袭性更强；胰腺癌MeCP2阴性表达组的肿瘤病理分级更高，淋巴结转移也更常见。这些结果进一步说明MeCP2表达阴性的，肿瘤细胞可能具有更强的侵袭性，但淋巴结转移与侵袭性之间有无联系，还需要更多的基础和临床研究进行验证。在癌旁组织中，MeCP2表达阳性率与病理分级和临床分期相关，与淋巴结转移无相关性，原因可能与取材位置有关。生存分析显示胰腺癌组织MeCP2表达水平与患者预后密切相关，且Cox模型显示癌组织MeCP2低表达是胰腺癌患者预后的独立危险因素。但在该模型中，淋巴结转移这一临床特征显示与患者预后无相关性。预后是各种影响因素综合作用的结果，淋巴结转移虽然与疾病本身的严重程度、病理分级等有关系，但它只是肿瘤预后的影响因素之一，当然也限于此次研究的样本量。

本研究具有两个方面的局限性。首先，这项研究是一个小样本量的回顾性研究，结果表明胰腺癌组织MeCP2高表达患者病理分级较低，癌旁组织中MeCP2高表达患者临床分期较早，虽然这一结果具有一定的指导意义，但后续仍需增加样本量，以便对此结论进行进一步验证，同时需要结合前瞻性研究加以证实；其次，局限于当前的医疗检查技术，胰腺癌淋巴结转移早期诊断仍是世界难题，CT、PET-CT容易漏诊，现有的肿瘤标志物又不能判断淋巴结转移与否，故在判别淋巴结转移与否并进行分组时，可能与真实情况存在偏差。总之，MeCP2表达在胰腺癌发生和发展中的作用机制及其评估预后的价值仍不清楚，需要更多的基础和临床研究成果进行支持。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突