吴冬梅，赵 旭，汪 坤，杨艳华，崔应麟

1)河南省中医院门诊部 郑州 450002 2)河南省中医院药学部 郑州 450002 3)河南省中医院脑病科 郑州 450002

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外伤性脑实质内的自发性出血，具有高发病率、高致死率和高致残率的特点；ICH会引起脑血肿、脑水肿、颅内压升高、脑损伤等一系列病理生理过程，其中脑损伤是引起ICH患者致死和致残的关键因素[1]，而且脑损伤后会引起行为学的改变。目前，ICH后脑损伤的治疗措施有低温保护、人工冬眠疗法，其目的在于降低脑的基础代谢而延缓病情发展；常用的治疗药物有脑细胞营养修复药物，包括神经节苷脂、脑蛋白水解物(脑活素)和清除自由基药物(依达拉奉)，但以上药物治疗都属于对症治疗[2]。中医对ICH的病机、治法治则、用药已经形成了成熟的体系[3]。有临床研究[4]提示，中药治疗ICH具有整体治疗、副作用小等优势。因此寻求中医药治疗ICH后继发性脑损伤，对降低ICH致残率、致死率具有重要意义。

有文献[5-6]报道，含大黄的方剂大承气汤和大黄素对脑出血大鼠均具有一定的脑保护作用。课题组的前期研究[7]也发现以大黄为君药的醒脑灌肠液对ICH模型大鼠具有显著的脑保护作用，说明大黄在ICH治疗中具有重要的应用价值，但其作用机制尚不清楚。为此，课题组开展了如下研究，探讨大黄对ICH模型大鼠的脑保护作用及机制，为大黄在ICH的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物和主要仪器雄性Wistar大鼠，共200只，体重250～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK(京)2016-0011。ZH-蓝星D型动物脑立体定位仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)，CPA324S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，生物显微镜(日本奥林巴斯公司)，全自动酶标仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。DYCZ-24DN垂直电泳槽、DYY-7C电泳仪电源、DYCZ-40电转仪(北京六一仪器厂)，磁力搅拌器(江苏金坛市中大仪器厂)，HI650离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.2主要试剂和药物Ⅶ型胶原酶(美国Sigma公司)，水合氯醛、多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na，天津致远化学试剂有限公司)，依文思蓝(Evans blue，EB；北京鼎国生物技术有限公司)，RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，谷胱甘肽(GSH)测试试剂盒(南京建成生物工程研究所)。兔抗人Nrf2抗体(武汉三鹰生物技术有限公司公司)，TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10和IFN-γ ELISA检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)。

大黄购自安徽普仁中药饮片有限公司(批号1808043)，经河南省中医院黄小敏副主任药师鉴定为蓼科植物药用大黄的干燥根及根茎。大黄提取液的制备：体积分数75%乙醇回流提取2次(100 mL，80 mL)，每次1 h，合并提取液，过滤，浓缩至质量浓度为0.9 g/mL。阳性对照药安宫牛黄丸(北京同仁堂科技发展有限公司制药厂，批号16011928)，去除球壳，用5 g/L CMC-Na配制成含药0.18 g/mL的混悬液。

1.3ICH大鼠模型的制备参考文献[5]方法采用胶原酶注射尾状核法复制大鼠脑出血模型，Longa5级评分法评价模型是否成功。

1.4分组及给药实验分组为空白组、假手术组、ICH模型组、安宫牛黄丸组、大黄组，每组20只(200只大鼠分两批进行实验，每批100只)。大鼠禁食24 h(避免大鼠频繁排便，影响灌肠给药)，不禁水，清醒状态下不固定(毛巾盖住头部使其保持安静)进行灌肠给药；将导尿管插入大鼠直肠，深度不超过4 cm，后端连接注射器吸取药物并1 mL/min推注水浴加温至30 ℃的药液。

空白组(不造模，生理盐水灌肠)、假手术组(按照ICH造模方法操作但不注射胶原酶，生理盐水灌肠)、ICH模型组(造模，生理盐水灌肠)、安宫牛黄丸组(造模，灌肠给药安宫牛黄丸混悬液0.27 g/kg)、大黄组(造模，灌肠给药大黄提取液3.60 g/kg)5个实验组，每组设4个时间点进行实验或取样(每组每个时间点均为5只大鼠)，各组动物灌肠1次/d。第一次灌肠后于12 h、24 h进行实验或取样，为12 h、24 h两个检测时间点；剩余大鼠继续给药2 d后、6 d后实验或取样，为3 d、7 d两个检测时间点。

1.5EB法检测ICH大鼠血脑屏障的通透性参考文献[7]方法，按照1.4项的操作方法，分别于给药后12 h、24 h、3 d、7 d 4个时间点腹腔注射体积分数10%的水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠(第一批大鼠)并固定，然后按照4 mL/kg的剂量左侧颈静脉注射20 g/L EB，大鼠全身变蓝后剖开胸腔，用注射针头从左心尖插入肺动脉，固定针头后剪开右心耳，生理盐水冲洗右心耳直至流出液清澈，在冰盘上迅速断头取脑并自正中线切开，用滤纸吸干出血侧脑组织表面的水分，称脑组织的重量。脑组织放置于5倍体积的甲酰胺中，60 ℃水浴放置24 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液，用分光光度计在620 nm处测定吸光度(以甲酰胺标准液做空白对照并做标准曲线)，计算脑组织中EB含量(脑组织EB含量=样品EB浓度/脑湿重)。

1.6大鼠脑功能损伤程度评分采用改良的神经功能损伤程度评分(modified neurological severity score，mNSS)对各组大鼠(第二批大鼠)脑损伤程度进行评价[6]。按照1.4项的操作方法，分别于给药后12 h、24 h、3 d、7 d 4个时间点记录每只大鼠的mNSS得分，分析每组大鼠神经功能损伤及恢复情况。

1.7大鼠血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10、GSH含量的ELISA 法检测按照1.4项的操作方法，分别于给药后12 h、24 h、3 d、7 d后4个时间点每组各取5只大鼠(第二批大鼠)，腹主动脉取血，离心后取上层血清，采用ELISA法检测大鼠血清中GSH、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10和IFN-γ含量，具体步骤参照试剂盒说明书进行。

1.8大鼠脑组织中Nrf2蛋白表达的Western blot检测1.7项中的大鼠采血后迅速断头处死，开颅并剥离、保留出血侧脑组织，PBS冲洗干净后进行总蛋白提取、浓度测定。取每个样品的总蛋白40 μg加入电泳槽的上样孔，进行电泳分离；将样品凝胶中的蛋白转印至PVDF膜(转膜条件为GAPDH：200 mA 90 min；Nrf2：200 mA 120 min后300 mA 30 min)；转膜后室温封闭2 h；加入一抗(GAPDH按1∶1 000稀释；Nrf2按1∶600稀释)4 ℃孵育过夜；封闭液洗涤PVDF膜6次，5 min/次；加入二抗(按1∶50 000稀释)37 ℃摇床孵育2 h，封闭液洗涤PVDF膜6次，5 min/次。滴加ECL进行显色，反应至荧光带明显后，吸去多余液体，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次显影、定影、冲洗胶片。晾干后扫描胶片，用BandScan 5.0软件分析胶片灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值表示Nrf2蛋白的表示相对表达量。

1.9统计学处理采用SPSS 25.0进行数据分析，应用单因素方差分析比较各组大鼠及其不同时间点脑组织中EB含量，mNSS评分，血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10、GSH含量以及出血侧脑组织中Nrf2蛋白相对表达量的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠不同时间点血脑屏障的通透性的变化见表1。由表1可知，ICH模型组与假手术组比较，EB含量升高(P<0.05)，说明ICH模型组大鼠血脑屏障通透性增加，3 d时达到峰值。与ICH组比较，安宫牛黄丸组大鼠脑组织EB含量降低(P<0.05)，大黄组在12 h、3 d时大鼠脑组织EB含量降低(P<0.05)。

表1 各组大鼠不同时间点脑组织中EB含量比较(n=5)

2.2各组大鼠mNSS评分的比较空白组4个时间点mNSS评分均为0；假手术组12和24 h mNSS评分均为(2.24±0.39)，3和7 d时mNSS评分均为0。其余3组mNSS评分见表2。由表2可知，ICH模型组mNSS评分升高，说明出血模型造模成功；且随着出血的发展，mNSS评分升高，3 d时达到峰值。与ICH模型组比较，安宫牛黄丸组在4个时间点时大鼠的mNSS评分均降低(P<0.05)，大黄组在3 d、7 d时大鼠的mNSS评分降低(P<0.05)。

表2 各组大鼠不同时间点mNSS评分比较(n=5)

2.3各组大鼠不同时间点血清中TNF-α含量的比较见表3。由表3可知，与假手术组比较，ICH模型组大鼠4个时间点血清中TNF-α的含量均增加(P<0.05)。与ICH模型组比较，安宫牛黄丸组大鼠4个时间点血清中TNF-α的含量降低(P<0.05)；大黄组在24 h、3 d、7 d时TNF-α的含量降低(P<0.05)。

2.4各组大鼠不同时间点血清中IL-6含量的比较见表4。由表4可知，与假手术组比较，ICH模型组大鼠4个时间点血清中IL-6的含量升高(P<0.05)。与ICH模型组比较，安宫牛黄丸组和大黄组大鼠4个时间点血清中IL-6的含量均降低(P<0.05)。

表3 各组大鼠不同时间点血清中TNF-α含量的比较(n=5) ng/L

表4 各组大鼠不同时间点血清中IL-6含量的比较(n=5) ng/L

2.5各组大鼠不同时间点血清中IFN-γ含量的比较见表5。由表5可知，空白组与假手术组比较，ICH模型组大鼠4个时间点血清中IFN-γ的含量增加(P<0.05)。与ICH模型组比较，安宫牛黄丸组和大黄组大鼠4个时间点血清中IFN-γ的含量均降低(P<0.05)。

表5 各组大鼠不同时间点血清中IFN-γ含量的比较(n=5) ng/L

2.6各组大鼠不同时间点血清中IL-4含量的比较见表6。由表6可知，与假手术组比较，ICH模型组大鼠血清中IL-4的含量在出血后12 h升高(P<0.05)，然后随着出血的进展，在24 h、3 d、7 d时IL-4的含量降低(P<0.05)。与ICH模型组比较，安宫牛黄丸组大鼠4个时间点血清中IL-4含量均升高(P<0.05)；大黄组IL-4含量在3 d、7 d时升高(P<0.05)。

表6 各组大鼠不同时间点血清中IL-4含量的比较(n=5) ng/L

2.7各组大鼠不同时间点血清中IL-10含量的比较见表7。由表7可知，与假手术组比较，ICH模型组大鼠血清中IL-10的含量在出血后12 h是先升高，然后随着出血的进展，在24 h、3 d、7 d时IL-10的含量降低(P<0.05)。与ICH模型组比较，安宫牛黄丸组和大黄组大鼠血清中IL-10的含量在24 h、3 d和7 d时升高(P<0.05)。

表7 各组大鼠不同时间点血清中IL-10含量的比较(n=5) ng/L

2.8各组大鼠不同时间点血清中GSH含量的比较见表8。由表8可知，与空白组相比，假手术组GSH含量差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，ICH模型组大鼠4个时间点血清中GSH的含量降低(P<0.05)，说明ICH过程中生成大量ROS，它能够消耗GSH并使其水平降低。与ICH组比较，安宫牛黄丸组大鼠4个时间点血清中GSH的含量增加(P<0.05)；大黄组大鼠血清中GSH的含量在24 h、3 d、7 d时增加(P<0.05)。

表8 各组大鼠不同时间点血清中GSH含量的比较(n=5) μmol/L

2.9各组大鼠不同时间点出血侧脑组织中Nrf2蛋白相对表达量的比较见表9。由表9可知，与空白组相比，假手术组出血侧脑组织中Nrf2蛋白的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，在12 h、24 h、3 d、7 d时ICH模型大鼠出血侧脑组织中Nrf2蛋白的相对表达量升高(P<0.05)。与ICH组比较，安宫牛黄丸组出血侧脑组织中Nrf2蛋白的相对表达量升高(P<0.05)；大黄组大鼠出血侧脑组织中Nrf2蛋白的相对表达量在3、7 d时升高(P<0.05)。

表9 各组大鼠不同时间点出血侧脑组织中Nrf2蛋白相对表达量的比较(n=5)

3 讨论

现代药理研究[8]表明，安宫牛黄丸可以通过抗氧化、抗炎等作用改善患者认知功能和神经功能，因此本研究中选择安宫牛黄丸为阳性对照药物。本实验结果显示安宫牛黄丸在大鼠ICH中表现出明确的抗氧化、抗炎效应，指标显现相应的改变。大黄是我国常用中药之一，具有清热攻积、泻火凉血、逐瘀解毒之功效，其主要活性成分为蒽醌类化合物，主要为大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸等。近年来，大黄及其活性成分对脑损伤的抗炎和抗氧化的作用研究越来越多：彭绍鹏等[9]采用自体血注入大鼠纹状体建立脑出血模型，以大黄素干预，发现大黄素治疗组能够降低TNF-α的含量，抑制炎性因子的释放，降低谷氨酸的表达水平，减轻脑出血后脑水；赵薇等[10]研究大黄酚对于脑缺血再灌注损伤的神经方面的保护作用时发现，大黄酚可以上调SIRT3的表达，增强SOD的抗氧化作用，增强抗细胞凋亡作用，下调AQP4的表达，进而减轻脑缺血后脑水肿的发生，发挥其对脑缺血再灌注的神经保护作用；毕勇志等[11]研究表明，大黄素可通过抑制 NF-κB信号通路，降低大鼠海马组织中促炎性细胞因子如 IL-6、IL-1β和 TNF-α的水平，抑制脑组织的炎症反应，发挥对局灶性脑缺血的神经保护作用。

血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)是保持脑组织生理环境的重要屏障，可以有效避免脑组织被循环血液中的有害物质损害，对保持中枢神经系统的有效生理功能具有重要意义[12]。本实验结果发现，大黄提取液干预ICH模型大鼠后，在3 d作用时间点可以有效降低血脑屏障通透性、改善mNSS评分，发挥了脑保护作用。

TNF-α、IL-6、IFN-γ均是脑出血后高表达的炎症细胞因子，这些炎症细胞因子在后续的继发性脑损伤中发挥着重要角色，通过炎性浸润激发基质金属蛋白酶表达，破坏血脑屏障，进而引起神经细胞凋亡[13-14]；抗炎细胞因子IL-4可以抑制TNF-α、IL-6的表达[15]；IL-10能降低炎症应激反应[16]。本实验结果发现，大黄提取液干预ICH模型大鼠后，可以显著上调IL-4、IL-10表达，下调TNF-α、IL-6、IFN-γ 表达，发挥抗炎作用。

ICH病理过程中发生的氧化应激反应是导致BBB破坏的重要机制[17]。氧化应激损伤与体内清除自由基的天然抗氧化物如GSH的消耗有关。ICH过程中生成的大量ROS能够消耗GSH，使其水平降低，进一步削弱血肿组织的抗氧化能力。Nrf2是维护机体抗氧化与氧化平衡的重要因子，在受到氧化应激等刺激后激活，转位到细胞核内，以Nrf2-Maf 的形式与ARE结合，通过相关激活程序，促使下游基因转录，常见的下游基因产物多是抗氧化物质，包括醌氧化还原酶、谷胱甘肽巯基转移酶、谷氨酰半胱氨酸连接酶以及血红素加氧酶1等，可有效对抗脑出血后的脑损伤[18]。本实验结果发现，大黄提取液干预ICH模型大鼠后，可以上调ICH模型大鼠脑组织中Nrf2蛋白的相对表达量、增加血清中GSH含量，发挥抗氧化应激作用，减轻脑损伤。

总之，本研究结果显示大黄可通过抗炎和抗氧化作用，起到保护血脑屏障的作用，从而发挥对ICH的脑保护作用。