刘 希,郑 娜，卢 宏

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)郑州市第三人民医院肾内科 郑州 450099

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是临床上最常见的痴呆类型。脑内出现淀粉样斑块形式及神经纤维缠结是AD典型的病理表现。AD早期患者常见近期记忆障碍及定向功能障碍，晚期患者则出现严重的认知功能下降及生活能力下降[1]，给患者及家属带来沉重的心理负担和经济负担。目前AD的临床治疗手段极为有限，胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐是FDA批准的为数不多的治疗AD的药物之一[2]，然而这些药物无法逆转AD的病程及挽救神经细胞凋亡。因此，深入研究AD的发病机制，找出有效的AD治疗手段势在必行。有研究[3]发现，具有神经毒性作用的Aβ蛋白在脑内异常聚集形成淀粉样斑块是导致AD发生的关键；Aβ单体是由淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid-beta precurser protein, APP)经分泌酶的一系列剪切而形成。Aβ单体聚集形成二聚体或多聚体，从而在细胞外沉积形成淀粉样斑块。β位点APP剪切酶2(β-site cleavage enzyme 2,BACE2)最初被认为能够处理APP并产生Aβ蛋白，是AD的“元凶”之一。我们前期的体外实验[4]发现，BACE2通过吞噬溶酶体途经降解，阻断这一降解途径不仅可提高内源性BACE2的表达，而且能有效降低Aβ前体的产生。最近，Azkona等[5]的动物实验证实了这一点, 在BACE2转基因的小鼠体内未发现Aβ蛋白过量分泌、胆碱能神经元丧失和记忆、学习能力的改变。以上结果提示增加内源性或外源性BACE2蛋白的表达水平可降低Aβ蛋白的表达。

本研究构建携带有人源性BACE2基因的病毒载体，通过侧脑室注射法感染APP/PS1 dE9转基因小鼠，观察小鼠脑内BACE2表达及淀粉样斑块形成情况，探究外源性BACE2是否对AD疾病有脑保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物与主要试剂APP/PS1 dE9转基因小鼠(3月龄，雄性，体重25～33 g)购于美国JAX Lab公司(编号：005864)。rAAV-hsn-WPRE-hGH-polyA质粒(美国Addgene公司)。鼠抗Aβ单克隆抗体6E10(美国Biolegend公司)，羊抗兔BACE2-FLAG多克隆抗体、鼠抗β-actin单克隆抗体AC15(美国Sigma-Aldrich公司)，二抗IgG(美国Invitrogen公司)。羊抗鼠APP C20(751-770)多克隆抗体(美国Sigma-Aldrich公司)，兔抗鼠BACE2单克隆抗体H-3(美国Santa Cruz公司)。

1.2BACE2表达质粒的构建与病毒包装参照NCBI 提供的人类BACE2基因序列(Reference Sequence: NM_012105.4)，将HEK293来源的BACE2全长表达片段PCR扩增，由NcoⅠ、NheⅠ内切酶酶切扩增产物后形成黏末端片段，插入rAAV-hsn-WPRE-hGH-polyA 质粒，经T4连接酶连接后形成AAV-hsn-BACE2-3×FLAG-WPRE-hGH-polyA病毒表达质粒，空白对照质粒无序列插入。AAV病毒的包装由武汉枢密生物科技有限公司完成，获得携带有人源BACE2基因的AAV-BACE2-FLAG和阴性对照AAV-FLAG。

1.3实验分组与侧脑室立体定位注射20只APP/PS1 dE9小鼠分为AAV-BACE2组和阴性对照组，每组10只。采用异氟烷吸入法深度麻醉小鼠，固定于立体定位仪。常规消毒头部皮肤，沿矢状缝以前囟前0.5 mm为起点作1 cm切口。以前囟为坐标原点，取坐标定位(-0.8,±1.2,-3.0)为注射标记点，用磨钻将标记点钻开，AAV-BACE2组和阴性对照组小鼠双侧侧脑室分别用Hamilton微量进样针缓慢注入滴度为1011个病毒颗粒/mL的相应病毒溶液4 μL。骨蜡封闭钻孔，缝合皮肤。术毕，待麻醉清醒后将小鼠送还笼内继续饲养。实验过程中遵循ARRIVE指南及3R原则保障动物福利，本研究符合国际和国家颁布的关于生物医学研究伦理要求。

1.4小鼠学习记忆能力的检测病毒注射3个月后，2组小鼠行Morris水迷宫测试。Morris水迷宫为直径120 cm、高50 cm的金属水池，内置直径为10 cm的逃避平台，淹没于水面下1 cm。水温由加热器控制在(24±1) ℃。空间学习包括4 d连续定位航行实验及第5天空间探索实验。记录每次小鼠从放入水中开始计时到搜索到淹没于水面的平台为止的时间为逃避潜伏期。如果小鼠在60 s内未能搜索到平台则记录为60 s，然后研究者手动在10 s内帮助小鼠找到水下隐藏的平台。在第5天的探索实验中，撤去水中平台，将小鼠放入平台对侧象限，给与60 s自由搜寻时间，记录小鼠穿过原先平台所在象限区域的次数及游泳速度。

1.5海马区淀粉样斑块和BACE2蛋白定位的检测采用免疫荧光染色法。行为学测试后对小鼠行安乐死，置于冰上，PBS灌注取脑。40 g/L多聚甲醛固定24 h，经300 g/L蔗糖溶液梯度脱水后OCT包埋，10 μm厚切片，体积分数10%的驴血清室温孵育30 min封闭非特异性抗原。加一抗(Aβ抗体按1∶200稀释，FLAG抗体按1∶500稀释)4 ℃孵育过夜，加二抗(按1∶2 000稀释)4 ℃孵育2 h。细胞核用含有DAPI的防光猝灭剂染色。用Leica TCSSP8激光共聚焦显微镜对染色后的切片进行观察拍照，采用LAX影像处理软件处理图像。每隔100 μm取1张切片，每只小鼠取3张，每张观察2个视野。计算每个视野中直径大于20 μm的染色斑块面积占视野总面积的百分比，取均值。

1.6海马区APP和BACE2蛋白表达的检测小鼠海马组织经RIPA裂解液裂解、匀浆，采用Bradford法检测蛋白浓度后，加到70 g/L SDS-PAGE上进行电泳。将蛋白转至0.2 μm PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉溶液封闭，加一抗(APP和BACE2-FLAG抗体按1∶2 000稀释； β-actin抗体按1∶5 000稀释)4 ℃孵育过夜，加二抗(按1∶5 000稀释)室温孵育2 h，采用凝胶成像系统检测。由Image J 分析，用目的蛋白与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.7统计学处理采用SPSS 19.0分析。2组小鼠脑组织海马区淀粉样斑块面积百分比及APP蛋白表达的比较采用两独立样本t检验；2组小鼠空间学习记忆能力比较采用重复测量数据的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.12组小鼠空间学习记忆能力比较2组小鼠的游泳速度无差异,说明小鼠的运动功能未受到明显的影响。AAV-BACE2组小鼠第4天逃避潜伏期短于阴性对照组(表1)。AAV-BACE2组小鼠的平台穿越次数为(3.0±0.4)，高于阴性对照组的(1.3±0.4)(t=2.940，P=0.009)。

2.22组小鼠脑组织海马区淀粉样斑块面积百分比及APP蛋白表达的比较结果见图1、2和表2。

表1 2组小鼠空间学习记忆能力比较

图1 2组小鼠脑组织海马区淀粉样斑块的表达

图2 2组小鼠脑组织海马区APP蛋白的表达

表2 2组小鼠脑组织海马区淀粉样斑块面积百分比及APP蛋白表达的比较

2.3人源性BACE2蛋白在APP/PS1dE9小鼠脑组织的定位表达人源性BACE2蛋白在小鼠脑内海马区域广泛高表达且与神经元特异标记Neun共定位(图3)。Western blot 结果显示AAV-BACE2组小鼠脑组织人源性BACE2表达较阴性对照组明显升高(图4)。

图3 AAV-BACE2组小鼠脑组织BACE2蛋白的表达

图4 2组小鼠脑组织BACE2蛋白表达的Western blot结果

3 讨论

关于BACE2在AD发病机制中的作用一直存在激烈的争论。 和APP一样，BACE2基因同样位于第21号染色体q22.3,且定位接近APP基因。在唐氏综合征患者体内BACE2表达提高，在中年后患者不可避免地出现AD的病理变化并表现出与AD相同的临床表现[6-7]。作为天冬氨酸蛋白酶体BACE1的同系物，BACE2氨基酸序列与BACE1有75%相同。与BACE1在神经细胞内大量表达不同，BACE2在神经细胞内表达量很低或几乎不表达[8]。有研究[9]证实，APP被BACE2剪切的位点位于Aβ的结构域内，既不同于α位点，又不同于β位点，也和γ位点不同，产生APP C-末端片段为C80，因此被称为θ位点。有研究[10]报道BACE2是一个条件性的β位点剪切酶，其剪切作用与APP的跨膜结构域有密切联系，且受到Clusterin蛋白密切调控。由于正常生理状态下BACE2在脑内表达量极低，作者推测提高内源性的或引入外源性的BACE2可能阻断BACE1对APP的剪切作用，从而降低Aβ的产生。前期的体内实验[6]在细胞层面印证了可以通过阻断BACE2降解提高细胞内源性BACE2的表达，抑制BACE1剪切APP，但通过抑制BACE2降解来提高内源性BACE2实际难以实现。作者认为可通过转基因手段提高体内外源性BACE2的表达。

鉴于AD动物模型APP/PS1 dE9转基因小鼠携带的是人APP和PS1基因[11]，本研究创新性地将人源性BACE2基因转入APP/PS1 dE9转基因小鼠脑内，使其过量表达，以更好地促进临床前研究的转化。此外，作者首次采用无害性且具有血脑屏障穿透性的血清型AAV病毒作为外源基因携带工具[12]。本研究结果表明提高BACE2的表达可以减少Aβ原料APP的表达，降低小鼠脑组织海马区淀粉样斑块面积百分比。且行为学评价显示，AAV-BACE2组小鼠显示出较好的记忆和空间学习能力。以上结果表明引入人源性BACE2基因对AD动物模型有脑保护作用。

BACE2和BACE1一样属于天冬氨酸蛋白酶体家族成员，BACE2的底物不仅限于脑内的APP，而且还有很多底物，例如BACE2可剪切胰岛IAPP降低纤维化的胰岛APP生成[13]，剪切黑色素细胞内的细胞特异性黑色素前体蛋白生成黑色素等[14]，从而参与不同的生理过程。本研究首次将人源性BACE2基因引入成年动物脑内，发现动物体内BACE2对APP有剪切作用，而BACE2在脑内是否参与其他蛋白的剪切以及过表达BACE2对大脑生理功能是否存在不利作用需进一步研究。

综上所述，本研究加深了对BACE2在AD发病机制中的认识，为AD的治疗提供了新的治疗靶点，可望为AD的基因治疗提供理论基础。