赵水英，秦贵军，李志臻，马晓君，孟栋栋，任高飞

郑州大学第一附属医院内分泌科 郑州 450052

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是甲状腺癌中最常见的类型，新发病例数占所有甲状腺癌的80%～90%，且发病年龄呈现年轻化趋势[1]。转移是影响PTC预后的关键因素，约1/3患者在疾病早期出现颈部淋巴结转移或远处转移[2]。因此，寻找PTC发生发展、侵袭转移的相关分子靶点对延缓肿瘤进展、改善患者预后具有深远意义。

叉头状转录因子3(forkhead box protein 3，Foxp3)是叉头/翼状螺旋转录因子家族中的重要成员，通过调控调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)参与免疫抑制过程[1-2]。近年来研究[3]证实，某些恶性肿瘤细胞可自身表达Foxp3，但其具体作用机制仍有待研究。BRAF V600E基因突变是PTC中最常见的遗传学事件，是肿瘤侵袭性临床表型和预后不佳的指标[4]。本研究通过检测PTC组织中Foxp3的表达水平并分析其与临床病理参数以及BRAF V600E基因突变的关系，探讨Foxp3作为PTC治疗靶点的潜在价值。

1 对象与方法

1.1研究对象收集2019年1月至10月郑州大学第一附属医院甲状腺外科手术切除并经病理学确诊的147例PTC患者的癌组织标本。147例中男42例，女105例，年龄21～63岁，其中56例多灶性PTC(24例微小PTC，41例发生淋巴结转移)，91例单灶性PTC(49例微小PTC，38例发生淋巴结转移)，均不合并其他甲状腺疾病或肿瘤。癌旁正常甲状腺组织取自69例同期手术切除组织，69例中男21例，女48例，年龄24～62岁。所有组织标本均经术中快速冰冻及术后常规病理检查确认。本研究获得郑州大学第一附属医院伦理委员会审批同意，标本采集前患者均签署知情同意书。

1.2PTC组织及癌旁正常甲状腺组织中Foxp3mRNA与蛋白表达的检测

1.2.1 qRT-PCR 取液氮中冷冻新鲜组织并研磨至粉末状，按照Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书步骤提取总RNA，反转录获取cDNA，PCR扩增检测Foxp3 mRNA。反转录试剂盒、PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。Foxp3上游引物：5’-CA CAACATGCGACCCCCTTTCACC-3’，下游引物：5’-AGGTTGTGGCGGATGGCGTTCTTC-3’，β-actin上游引物：5’-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3’，下游引物：5’-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGCC-3’。反应体系：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，ROXⅡ 0.4 μL，SYPR Green Master Mix 10 μL,ddH2O 6.8 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算Foxp3 mRNA表达水平。每组设置3个复孔，实验结果重复3次，计算平均值。

1.2.2 免疫组化染色 标本经40 g/L多聚甲醛固定，组织脱水，石蜡包埋，4～ 5 μm厚切片，按照SP试剂盒说明书进行免疫组化染色，光镜下观察。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知染色阳性的大鼠脾脏组织作为阳性对照。结果评定标准：每张切片选取5个视野(×400)，参照Shu等[5]的研究，根据染色强度和阳性细胞百分比分别评分。染色强度：无明显着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性细胞百分比：无反应性0分，<5%为1分，5%～50%为2分，>50%为3分。最后两项得分相加，阴性(0分)和弱阳性(1～2分)为低表达，阳性(3分)和强阳性(4～ 6分)为高表达。

1.3BRAF V600E基因型分析提取癌组织DNA。上游引物：5’-TCATAATGCTTGCTCTGATAG GA-3’，下游引物：5’-GGCCAAAAATTTAATCAGTG GA-3’，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增BRAF V600E目的基因片段，扩增片段长度224 bp，测序仪检测BRAF基因突变情况。

1.4统计学处理应用SPSS 17.0处理数据。采用两独立样本t检验比较PTC组织和癌旁正常甲状腺组织以及不同临床病理特征的PTC患者癌组织中Foxp3 mRNA表达水平的差异，采用χ2检验比较PTC组织和癌旁正常甲状腺组织Foxp3蛋白的高表达率及Foxp3高、低表达组间BRAF V600E基因型突变率的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1Foxp3mRNA在PTC及癌旁正常甲状腺组织中的表达Foxp3 mRNA在PTC组织中的表达水平(2.57±0.84)高于癌旁正常甲状腺组织(1.00±0.35)(t=2.950，P=0.004)，并且与肿瘤TNM分期，有无包膜、脉管侵犯及淋巴结转移有关(P<0.05)，而与患者年龄、性别、肿瘤大小及是否多灶性无关(P>0.05)，见表1。

表1 不同临床病理特征PTC患者Foxp3 mRNA表达水平的比较

2.2PTC组织和癌旁正常甲状腺组织中Foxp3蛋白的表达及定位结果见图1和表2。PTC组织中Foxp3蛋白高表达，散在或局灶性表达于癌细胞的胞核、胞浆，肿瘤间质浸润的淋巴细胞中Foxp3蛋白亦呈阳性表达，而多数癌旁正常甲状腺组织中Foxp3蛋白呈阴性表达，仅少数可见上皮细胞胞浆中呈阳性表达。PTC组织中Foxp3蛋白高表达率高于癌旁正常甲状腺组织。

A:Foxp3在PTC细胞胞浆和胞核共表达；B：癌旁正常甲状腺上皮细胞Foxp3阴性表达；C:肿瘤间质浸润的淋巴细胞中Foxp3的表达

表2 PTC和癌旁正常甲状腺组织中Foxp3蛋白表达的比较

2.3不同Foxp3蛋白表达水平的PTC组织中BRAF V600E基因型突变情况结果显示，Foxp3蛋白高表达者BRAF V600E基因型突变率[68.0%(34/50)]高于低表达者[47.4%(46/97)](χ2=5.632，P=0.018)。

3 讨论

近年来PTC发病率不断攀升，虽绝大多数患者能通过手术和131I治疗获得治愈，但仍有10%的患者因低分化和进展期肿瘤而死亡[6]。探讨影响PTC侵袭转移的分子靶点及治疗手段是目前面临的重要课题。恶性肿瘤的发生发展与机体的免疫功能密切相关。CD4+CD25+调节性T细胞即Treg细胞，与自身免疫性疾病和肿瘤的发生发展密切相关[7-8]。Foxp3在Treg细胞分化发育、维持机体免疫耐受和免疫应答稳态等方面发挥重要作用[9]。近年来研究[3]证实，包括PTC在内的某些恶性肿瘤细胞表达Foxp3，但Foxp3在PTC细胞内定位及与患者临床病理特征的关系的报道不尽相同，有必要进一步深入研究。本研究选取不合并其他甲状腺疾病或其他肿瘤的PTC患者为研究对象，结果显示，与癌旁正常甲状腺组织相比，PTC组织中Foxp3 mRNA和蛋白的表达升高，与文献[10-11]报道一致。进一步分析Foxp3 mRNA表达水平与PTC患者临床病理特征之间的关系发现，Foxp3 mRNA与PTC患者TNM分期，有无脉管、包膜侵犯及淋巴结转移有关，提示Foxp3与PTC的发生发展有关。

Foxp3可通过调控一些抗炎因子如IL-10、TGF-β等的含量发挥免疫抑制功能，此外机体内有上千种蛋白的表达也受其调控[12-13]。据研究[14]，某些肿瘤细胞表达的Foxp3具有类似Treg细胞中的免疫抑制功能。在非小细胞肺癌细胞中，Foxp3与β-catenin和TCF4相互作用，激活Wnt/β-catenin信号传导通路，促进肿瘤EMT过程和转移[15]。目前Foxp3在PTC细胞的具体作用机制还有待进一步阐明。

本研究还发现，癌旁正常甲状腺组织仅少数上皮细胞胞浆内存在Foxp3蛋白表达，而PTC细胞Foxp3蛋白表达增强且多为核浆弥漫共表达，以胞核表达为主。蛋白的定位与功能密切相关，但PTC细胞中Foxp3的亚细胞定位目前的研究结果并不一致。Ugolini等[10]研究认为PTC细胞Foxp3的表达以胞浆为主，其次为核浆共表达和单纯核表达。Cunha等[11]认为分化型甲状腺癌细胞中Foxp3的定位模式为胞核表达多于胞浆。PTC细胞Foxp3的亚细胞定位及形成机制有待进一步扩大样本量或进行更深入的研究。

此外，本研究分析了PTC组织中Foxp3蛋白表达水平与BRAF V600E基因突变的关系，发现Foxp3高表达者BRAF V600E突变率高于Foxp3低表达者。BRAF V600E是PTC患者最常见的基因突变，与肿瘤的高侵袭性、淋巴结转移、高临床分期(Ⅲ～Ⅳ期)及易复发性相关[4-16]。BRAF V600E突变与Foxp3表达的关系还有待进一步的分子生物学研究及大样本量的临床病例资料分析证实。

综上所述，Foxp3 mRNA在PTC组织中表达增高，且与TNM分期，有无包膜、脉管侵犯及淋巴结转移有关；Foxp3蛋白细胞内定位模式与正常甲状腺上皮细胞中不同，同时Foxp3蛋白高表达者BRAF V600E突变率更高；以上均提示，Foxp3可能参与了PTC的发生发展。本研究为阐明PTC侵袭转移的机制提供了新思路，也为PTC的治疗提供了新的靶点。