夏天晴,李晨豪,李在禄,赵福江,徐丽丽,3,4*,鲍晓明,3

1.齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物工程学院,济南 250353 2.齐鲁工业大学(山东省科学院) 生物研究所,济南 250103 3.山东大学 微生物技术国家重点实验室,青岛 266237 4.山东圣琪生物有限公司,济宁 273517

南极磷虾(Antarctic krill)资源储量丰富稳定,是全球海洋中最大的单种可捕生物资源[1],南极磷虾资源尚无明确权属,在海洋资源的开发和争夺日趋激烈的大环境下,加快和提高南极磷虾资源开发利用具有重要的战略性意义。南极磷虾浑身是宝,被加工成冻虾、虾干、虾仁、虾酱等初级产品；南极磷虾营养价值很高,含有丰富的虾青素、维生素AD和B、磷脂、不饱和脂肪酸DHA和EPA等,可被深加工成南极磷虾油,具有一定的市场占有率,但对南极磷虾整体利用率尚有待提高,高附加值产品较少[2]。南极磷虾中蛋白质含量丰富,干重可达70%以上,其含有18种常见氨基酸,包括8种人体必需氨基酸(EAA)[3],经提取磷虾油后产生了大量的脱脂虾粉,目前主要用作水产饲料原料[4],其中含有大量蛋白质和营养成分,提高对这些蛋白质和营养成分利用对南极磷虾资源综合利用具有重要意义。

近年来,关于蛋白多肽的研究日益增多,研究表明小分子肽具有更高活性,且更易被人体吸收[5],具有较低分子量的南极磷虾蛋白水解产物已被证实具有对人体及动物有益的生物活性[6-9],目前蛋白肽水解物大多数用作动物饲料,由于制备蛋白多肽过程中,容易产生苦味,限制了其在食品工业中的应用。WIESER和BELITZ证实蛋白酶酶解后产生的苦味主要是由于蛋白酶酶解过程中,蛋白质分子的疏水性氨基酸侧链暴露出来,产生了呈现苦味的短肽即苦味肽,苦味程度与侧链的性质和数量,以及整个分子的疏水性有关[10]。因此,蛋白质的性质,蛋白酶种类和水解程度等因素均有可能影响苦味的产生。由于对各种蛋白酶特点没有完全认知,其水解位点具有不确定性,此外,原料中氨基酸组成和排列顺序具有不确定性,很难控制苦味的产生。故本文研究了六种市售蛋白酶酶制剂对脱脂南极磷虾粉的酶解效果,并利用感官评定的方法对酶解产物进行苦味评定,初步确定了各种蛋白酶的酶解效果,筛选出了酶解效果较高,去除苦味较佳的蛋白酶组合,为今后南极磷虾蛋白肽应用于食品工业领域打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

脱脂南极磷虾粉,由齐鲁工业大学(山东省科学院)赵福江老师提供；碱性蛋白酶(≥100 000 U/g)、中性蛋白酶(≥50 000 U/g)、风味中性蛋白酶(≥150 000 U/g)、氨基肽酶(≥60 000 U/g),山东隆大生物工程有限公司；风味酶(≥10 000 U/g)和木瓜蛋白酶(≥200 000 U/g),广西南宁庞博生物工程有限公司；Lowry法蛋白浓度测定试剂盒、超低分子量蛋白质Marker(3.3～31.0 kDa),北京索莱宝科技有限公司；预染蛋白质分子量标准(10～260 kDa),赛默飞世尔科技(中国)有限公司；SDS-PAGE凝胶电泳试剂包括十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰氨、甲叉丙烯酰胺、10% 过硫酸铵、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、Tris碱、盐酸、戊二醛、乙醇、考马斯亮蓝G-250、甲醇、乙酸等均为分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 实验仪器

DK-8B恒温水浴槽、DHG-9140A鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司；Fresco17台式高速离心机,赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Milli-Q Advantage A10超纯水系统,美国Millipore公司；PB-10酸度计、电子分析天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；酶标仪,美国伯腾仪器有限公司；SDS-PAGE电泳仪；小型蛋白转印槽。

1.3 实验方法

1.3.1 脱脂南极磷虾粉中总蛋白质含量测定

脱脂南极磷虾粉中总蛋白含量采用凯氏定氮法测定[11],蛋白质含量计算如下:

(1)

公式(1)中,X为脱脂南极磷虾粉中总蛋白质的含量(g/g)；V1为样品消耗硫酸标准滴定液的体积(mL)；V2为试剂空白消耗硫酸标准滴定液的体积(mL)；C为硫酸标准滴定溶液浓度(mol/L)；0.014为1 mL硫酸标准滴定溶液相当的氮的质量(g)；m为样品的质量(g)；V3为吸取消化液的体积(mL)；6.25为氮换算为蛋白质的系数。

1.3.2 脱脂南极磷虾多肽的制备

以干燥后的脱脂南极磷虾粉为原料,按照一定料液比加水混合,选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味中性蛋白酶、氨基肽酶、风味酶和木瓜蛋白酶六种蛋白酶分别在最适酶解条件下(表1所示)酶解3 h,酶解结束后,沸水浴处理10 min灭活,冷却后,利用离心机5 000 r/m离心15 min,获得酶解上清液,其中含有部分可溶性大分子量蛋白、多肽和氨基酸。

表1 蛋白酶酶解条件

1.3.3 蛋白酶酶解效果评价

以酶解上清液中可溶性蛋白质含量为指标评价各蛋白酶酶解效果。酶解上清液中蛋白含量(mg/g)采用Folin-酚法(即Lowry法)测定,操作按照Lowry法蛋白浓度测定试剂盒说明书进行,在650 nm处测定光吸收值,计算蛋白浓度,以蛋白质浓度(mg/mL)为横坐标,吸光度值A650为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程为:y=0.033 9x+0.026 4,R2=0.997 4。

1.3.4 感官品评

采用感官品评的方法对酶解上清液进行苦味评定[12-13]。将酶解上清液pH调整到7.0,挑选7名无感官问题的品评人员进行品评,评定人员要求在苦味评定前2 h禁水进食,评价员用蒸馏水漱口之后,品评待评定液,10 s后吐出,漱口后间隔5 min品评标准液,评定人员参照标准去对样品进行评定(如表2),取平均值表示苦味程度。

表2 苦味值的评定标准

1.3.5 SDS-PAGE电泳分析

选取4%的分离胶和15%浓缩胶对酶解上清液进行蛋白质电泳,具体溶液配置如表3所示,取适量蛋白质样品与上样缓冲液混匀,加入点样孔。先用80 V电压持续电泳,至溴酚蓝指示剂前沿进入浓缩胶与分离胶的界面时,再调整电压至110 V,至指示剂前沿到达分离胶前沿1～2 cm处停止电泳,取出凝胶在固定液(0.5%戊二醛30%乙醇混合液)进行固定处理20 min。采用考马斯亮蓝G250方法进行染色[14],再用对应脱色液脱色,放置在脱色摇床上每隔3 h更换一次脱色液,直至各条带清晰。

表3 凝胶配置 mL

1.3.6 数据分析

所有实验重复3次,结果表示均值±标准偏差。数据处理采用Excel和Origin软件。

2 结果与分析

2.1 脱脂南极磷虾粉中蛋白含量测定

经凯氏定氮法测定[11],脱脂南极磷虾粉中蛋白质含量为71.98%,与全沁果等报道基本一致[15]。

2.2 不同料液比对蛋白酶酶解效果的影响

料液比可能影响蛋白酶对脱脂南极磷虾粉的酶解效果。研究分别以料液比1∶3、1∶5、1∶7、1∶9和1∶10,在温度为50 ℃,pH为10.5,酶底物浓度为3%,酶解时间为3 h的条件下,利用碱性蛋白酶酶解脱脂南极磷虾粉,以Folin-酚法测定的酶解上清液中的可溶性蛋白质(包括大分子量蛋白质和小分子量多肽)含量为指标,评估料液比对碱性蛋白酶的酶解效果的影响,由图1可知,随着料液比的增加,酶解上清液中可溶性蛋白含量随之增加,料液比为1∶9时,酶解上清液中可溶性蛋白质含量最高,为0.62 g/g,酶解效果较好；料液比为1∶10时,酶解上清液中蛋白含量变化不大,综合考虑,选择1∶9的料液比进行后续酶解。

图1 不同料液比对脱脂南极磷虾粉酶解效果的影响

2.3 不同蛋白酶对脱脂南极磷虾蛋白的酶解效果比较

以Folin-酚法测定的酶解上清液中可溶性蛋白质含量为指标,评价6种蛋白酶的酶解效果如图2所示,碱性蛋白酶处理得到的酶解上清液中可溶性蛋白质含量最高,可达0.62 g/g,酶解效果最好；中性蛋白酶和风味酶次之,酶解上清液中可溶性蛋白质含量分别为0.56 g/g和0.51 g/g；风味中性蛋白酶处理得到的酶解上清液中可溶性蛋白质含量为0.33 g/g,酶解效果略低；氨基肽酶和木瓜蛋白酶处理得到的酶解上清液中可溶性蛋白质含量仅有0.12 g/g,酶解效果最低。酶解效果较好的碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味酶中均含有作用广泛的内切蛋白酶或同时含有内切蛋白酶和外切蛋白酶；风味中性蛋白酶也含有内切蛋白酶和外切蛋白酶,但主要作用于肽链C端或N端的疏水性氨基酸形成的肽键,酶解效果略低；木瓜蛋白酶虽然也属于内切肽酶,但其对含巯基(—SH)肽链特异性较强,因此呈现出较差的酶解效果；而氨基肽酶属于外切肽酶,酶解效果也较差,说明脱脂南极磷虾蛋白的彻底酶解需要内切蛋白酶和外切蛋白酶协同作用。

图2 不同蛋白酶对脱脂南极磷虾粉的酶解效果比较

对各蛋白酶的酶解上清液进行感官评定,结果如图3所示,利用酶解效果较好的碱性蛋白酶和中性蛋白酶处理得到的酶解上清液苦味值最高,为8.27和8.11,处于较苦等级；具有改善风味作用的氨基肽酶、风味中性蛋白酶和风味酶酶解产物的苦味值均不高,分别为2.33、2.7和2.81,处于微苦等级；而木瓜蛋白酶酶解产物的苦味值也不高,为3.29,推测木瓜蛋白酶酶解效率较低,产生的苦味肽也少。

图3 不同蛋白酶酶解上清液的感官品评结果

2.4 复配蛋白酶组合的酶解效果和酶解产物评价

我们最终确定了酶解效果较好的是碱性蛋白酶和中性蛋白酶,风味酶酶解效果次之,酶解效果较差的是氨基肽酶、风味中性蛋白酶和木瓜蛋白酶；酶解效果较好的蛋白酶在酶解过程中往往产生的苦味多,这是由于苦味肽是伴随酶解过程中产生的,为了达到同时提高脱脂南极磷虾蛋白的酶解效果和减少酶解产物苦味产生的目的,我们从以上六种蛋白酶中选择了酶解效果较好的碱性蛋白酶与能减少苦味产生效果较好且酶解效果较高的风味酶以1∶1配比,将碱性蛋白酶与风味酶及氨基肽酶以1∶1∶1配比(复配蛋白酶组合2)依次酶解(根据表1中所列酶解条件进行),以酶解上清液中的可溶性蛋白质含量为指标,评估复配蛋白酶组合的酶解效果,结果如图4所示,两个复配蛋白酶组合酶解产生的可溶性蛋白质含量均高于单一蛋白酶,特别是复配蛋白酶组合2的酶解上清液中的可溶性蛋白质含量比单一碱性蛋白酶提高了13%。对酶解上清液进行感官评定,结果如图5所示,两个复配蛋白酶组合的酶解上清液的苦味强度均明显低于单一碱性蛋白酶,其中复配蛋白酶组合1的酶解上清液苦味强度为5.56,复配蛋白酶组合2的酶解上清液苦味强度接近风味酶,仅为3.69,苦味强度降低为微苦等级。说明碱性蛋白酶能较好的酶解脱脂南极磷虾粉,同时也产生了较强的苦味,现有风味酶能较好地降低脱脂南极磷虾多肽混合物的苦味强度,但有可优化的空间,添加氨基肽酶可进一步降低其苦味强度。

图4 复配蛋白酶组合对脱脂南极磷虾粉的酶解效果比较

图5 复配蛋白酶组合酶解上清液的感官品评结果

通过考马斯亮蓝染色法[14]得到如图6所示复配蛋白酶组合与单一蛋白酶酶解产物的蛋白电泳条带,通过对比分析,未经酶解的上清液中除了含有分子量较高的蛋白外,也有少量低分子量蛋白(图6,泳道1),这些蛋白可能是在脱脂过程中产生的；经复配蛋白酶组合2酶解的产物分子量主要集中在14.4 kDa以下(图6,泳道2)；而复配蛋白酶组合1、碱性蛋白酶和风味酶的酶解产物分子量跨度比较大,一部分集中在14.4 kDa以下,另外还产生了其它5条明显的蛋白质条带,其分子量分布在30～260 kDa之间(图6,泳道3,4和5),说明碱性蛋白酶、风味酶及复配组合1(碱性蛋白酶+风味酶)酶解不完全；经氨基肽酶酶解的产物主要集中在14.4 kDa以下(图6,泳道6),还有一部分大分子量蛋白分布。复配组合2蛋白酶组分丰富,酶解较完全,能将大部分脱脂南极磷虾蛋白水解成分子量较小的产物,说明脱脂南极磷虾蛋白的水解需要各种蛋白酶协同作用。

注:M1:蛋白质分子量标准1,从小到大依次为3.3、6.5、14.4、20.1和31 kDa；M2:蛋白质分子量标准2,从小到大依次为10、15、25、35、45、60、75、100、140和260 kDa；泳道1:未经酶解的负对照；泳道2:复配蛋白酶组合2酶解；泳道3:复配蛋白酶组合1酶解；泳道4:碱性蛋白酶酶解；泳道5:风味酶酶解；泳道6:氨基肽酶酶解

3 结 论

采用六种蛋白酶即碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味中性蛋白酶、氨基肽酶、风味酶和木瓜蛋白酶分别酶解脱脂南极磷虾粉,通过评价蛋白酶的酶解效率、酶解产物的苦味值和分子量,确定了碱性蛋白酶(含有内切蛋白酶)的酶解效果较好,产生苦味最少的蛋白酶是氨基肽酶、风味中性蛋白酶和风味酶(均含有外切肽酶),说明提高脱脂南极磷虾蛋白的酶解效果和减少苦味产生需要内切蛋白酶和外切肽酶协同作用。我们将酶解效果最佳的碱性蛋白酶与产生苦味较少的风味酶以及氨基肽酶(即复配蛋白酶组合2)依次酶解,与单一碱性蛋白酶相比,产生的可溶性蛋白质含量提高了13%,酶解产物的苦味值降低了55%,SDS-PAGE电泳结果显示该复配蛋白酶组合的酶解产物分子量较集中,在14.4 kDa以下。我们也注意到各蛋白酶组分所占比例对酶解效率和苦味产生影响较大,目前,尚不能确定酶解的产物含有多少个氨基酸的短肽。下一步将进一步优化内切蛋白酶和外切蛋白酶的配比,分析酶解产物的分子量分布,以实现适用于酶解脱脂南极磷虾蛋白的蛋白酶精准定制,形成制备南极磷虾多肽的成熟工艺。