陈馨宁，黄 斐，沈敏娜，杨轶慧，王蓓丽,2，郭 玮,2

1.复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032 2.复旦大学附属中山医院厦门医院检验科，福建 厦门 361015

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或当细胞凋亡后释放进入循环系统，存在于血液、尿液、脑脊液等体液中。ctDNA分析能够快速甄别细胞信号通路上的基因突变情况并且能够定量ctDNA的突变丰度［1-3］。

常规基因测序技术如Sanger测序、焦磷酸测序只能检测出高负荷肿瘤或ctDNA含量较高的患者体内的肿瘤突变片段。随着DNA测序技术的快速发展，已实现对痕量DNA分子进行定量分析。常见的ctDNA检测技术有二代测序（next generation sequencing，NGS）、微滴式数字聚合酶链反应（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）、MALDI-TOF等。

本文建立了NGS和MALDI-TOF两个分析平台，检测转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）患者血浆ctDNA中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因的常见突变；分析两个平台在检测血浆ctDNA突变中的性能及血浆ctDNA在指导临床诊疗方面的潜在价值。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取2016年6月—2017年1月复旦大学附属中山医院收治的30例mCRC患者。

1.2 入选标准

患者均经活组织病理学检查确诊为结直肠腺癌，临床分期为Ⅳ期（即转移性癌）且均有3处及以上转移灶，所有患者的活检组织都接受过分子诊断，明确了KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因的突变状态。每例患者收集2管10 mL乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝全血，明确采血时间和采血时的患者状态。

1.3 方法

1.3.1 标本预处理

抽取10 mL外周血全血（EDTA抗凝管）。采用两步离心法，1 600×g，4 ℃离心10 min后吸取离心后的血浆，16 000×g，4 ℃再次离心10 min，吸取上清，-80 ℃冻存备用。使用QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit（德国Qiagen公司）抽提ctDNA。ctDNA定量使用Qubit dsDNA HS Assay Kit核酸定量分析试剂盒（美国Invitrogen公司），由ctDNA-Qubit 3.0得到具体浓度后用高灵敏度DNA分析试剂盒（5067-4678）在Agilent 2100 Bioanaylzer上进行样本质量控制。……